张煜，吴芬芳，张梦，田海山，李校堃

    温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035

    近年来糖尿病已发展成为威胁人类健康的主要重大疾病[1-2]，而糖尿病性血管并发症是该病最主要的致残致死原因[3-5]，内皮功能障碍是其发病的主要机制之一。持续的高血糖状况导致心血管内皮细胞代谢紊乱和氧化应激，从而引起渗透性增加、内皮舒张受损等，最终导致血管损伤[6]。因此，发现修复内皮细胞损伤的候选药物，研究其促血管修复作用的机制对糖尿病性血管并发症的治疗具有重要意义，并可能会揭示其新的潜在治疗靶点。

    成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor 4，FGF4)是由hst-1原癌基因编码的一种生长因子[7-8]。研究表明，FGF4蛋白在体内外均具有显著的促血管生成活性，并被证明在新生毛细血管的生长及在动脉生成过程中发挥关键作用[9]。据 此，我们在GenBank中查找到人FGF4(hFGF4)的编码基因，通过密码子优化在大肠杆菌中高效表达并纯化，对高糖诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)模型的修复及相关作用机制开展研究。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、载体及细胞：原核表达载体pET3d、大肠杆菌DH5α感受态细胞和大肠杆菌BL21(DE3)PlysS宿主菌均由本实验室提供，原代HUVEC及NIH3T3细胞均由实验室自备。

    1.1.2 主要试剂：质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶NcoI和BamHI均购自英国BioLabs公司；Triton X-100购自北京索莱宝科技有限公司；氨苄霉素、氯霉素以及IPTG购自上海捷瑞生物工程有限公司；去氧胆酸钠购自合肥Biosharp公司；DMEM低糖培养基和MCDB131培养基购自美国Gibco公司；ECM培养基购自美国ScienCell公司；PMSF、丙二醛(methylene dioxyamphetamine，MDA)检测试剂盒以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；p-JNK、JNK、p-p65、p65、p-p38、p38、β-actin等抗体均购自美国CST公司；rhFGF2(bFGF)蛋白由本实验室制备。

    1.1.3 HUVEC的原代分离及培养：无菌条件下，将人脐带放入含预热PBS的培养皿中，剪去血肿部分并挤出脐带血。将平针头注射器从一端插入脐静脉 ......