林婷婷，施克俭，金周晟，张裕坚，夏芳芳，刘乐

    温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015

    布比卡因是一种长效酰胺类局麻药，因起效较快、作用时间长、麻醉效能较强等优点被广泛应用于临床，但若误入血管可诱发严重的心脏毒性，甚至心脏停搏。1998年WEINBERG等[1]发现脂肪乳剂可增加布比卡因的毒性阈值，随后大量文献都证实了脂肪乳剂可解救布比卡因心肌毒性[2-3]，但其机制仍不完全清楚。近几年来，局麻药和自噬的关系陆续被报道：丁卡因可造成Vero肾细胞自噬体的累积和溶酶体损伤[4]，布比卡因可抑制C2c12成肌细胞自噬流造成大量自噬体堆积[5]，而XIONG等[6]发现局麻药可增加人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬体清除。但布比卡因是否通过调控自噬造成心肌毒性，脂肪乳剂是否通过调控自噬来解救布比卡因心肌毒性均鲜见报道。因此本研究通过建立布比卡因心肌毒性模型，用脂肪乳剂进行处理，检测心肌细胞损伤及自噬水平，探讨自噬在脂肪乳剂解救布比卡因心肌毒性中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料 H9C2心肌细胞株购自上海中科院细胞库。布比卡因(美国Sigma公司，B5274-5G)，20%脂肪乳剂Intralipid(华瑞制药有限公司，80EL046)，胎牛血清(美国Gibco公司，10099-141)，DMEM培养基(美国Gibco公司，C11995500BT)，CCK8细胞增殖毒性检测试剂盒(日本DOJINDO公司，CK04)，mRFP-GFPLC3双标腺病毒(上海汉恒生物科技有限公司，HBAP2100001)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo公司，23227)，微管相关蛋白1轻链3(microtubule- associated protein 1 light chain 3，LC3)抗体(美国Novus公司，NB100-2220SS)，p62抗体(英国Abcam公司，ab109012)，反转录cDNA合成试剂盒(美国Thermo公司，K1622)，GAPDH、MAP1LC3、p62引物(上海生工生物工程股份有限公司)，SYBR PCR试剂盒(日本Takara公司，RR820A)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：大鼠心肌H9C2细胞用含5%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)中培养。当细胞生长面积达到90%左右，PBS清洗培养瓶，0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心弃去消化液后用培养基重悬，吹打，制成单细胞悬液。细胞悬液按1:4传代 ......