于斐 曾晖翁鉴 林健静 解笑宸 孙军营 肖德明

    (北京大学深圳医院骨科，广东深圳518036)

    慢病毒介导SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型建立*

    于斐 曾晖**翁鉴 林健静 解笑宸 孙军营 肖德明

    (北京大学深圳医院骨科，广东深圳518036)

    背景：沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)基因是一个与衰老关系密切的基因，可以通过调节PI3K/AKT、NF-κB等信号通路影响到组织及机体的衰老过程，并参与骨科相关疾病的发生发展。建立慢病毒介导的SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型，可以为研究SIRT1基因相关的骨科系统疾病如骨关节炎、骨质疏松症等提供实验基础。目的：构建携带小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒载体，将其转染ATDC5细胞系，建立SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型。方法：根据RNAi序列设计原则设计并合成SIRT1基因的RNAi靶点序列，连接GV248(框架结构：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)载体，转化后经阳性克隆测序及PCR鉴定，质粒抽提后导入293T细胞，包装慢病毒，取上清检测滴度。将含有小鼠SIRT1基因RNAi的病毒颗粒转染ATDC5细胞系，并于荧光显微镜下进行观察，行RT-PCR检测ATDC5细胞中SIRT1 mRNA的表达情况。结果：经测序、PCR检测可知，SIRT1基因的RNAi靶点序列与GV248载体连接成功，并包装成高滴度的慢病毒。携带小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒感染ATDC5细胞后，荧光显微镜下观察显示感染率较高，RT-PCR检测发现，携带SIRT1基因的慢病毒感染组SIRT1基因mRNA的相对表达量为0.386±0.117，与阴性对照病毒感染组相比有统计学差异(P<0.05)，敲减效率为61.4%。结论：成功建立SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型，为研究SIRT1基因相关骨科系统疾病提供实验基础。

    基因；细胞；细胞模型；慢病毒属

    沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)基因是一个与衰老关系密切的基因[1]，位于10号染色体，编码的蛋白质由500个氨基酸残基构成，通过去乙酰化的方式参与到下游基因及蛋白的调控过程中，并通过控制新陈代谢[2]、调节细胞周期[3]、预防病毒感染[4]等多种作用参与到机体衰老进程。该基因具有高度保守的核心序列，可以通过多条信号通路，如AKT/PI3K[5]、NF-κB[6]等的作用参与到骨科系统相关疾病的发生发展中 ......