陈蓟 刘弼 熊怡胜 黄雪晴

    (暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院骨科，广东 深圳 518020)

    在骨关节炎(osteoarthritis,OA)研究中，已有越来越多的miRNA被发现与关节炎的发生有千丝万缕的联系，Microrna-34a(miR-34a)是其中之一[1]。已有研究[2]表明，miR-34a通过调节细胞周期从G1期过渡到S期，有抗增殖作用，miR-34a同样能由p53诱导，从而促进细胞凋亡和细胞周期阻滞。Sirt1基因亦是已被证实在OA发生发展过程中起重要作用[3]；然而miR-34a调控Sirt1在骨关节炎、软骨细胞中的研究报道较少见。本实验研究在IL-1β诱导的软骨细胞模型中，miR-34a对Sirt1的作用及其对Bcl-2的表达影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    DMEM高糖培养基、胎牛血清(Hyclone)；DAPI染色试剂盒(Sigma)；Lipofectamine 2000、RT-PCR试剂盒(Invitrogen)；miR-34a mimic(RiboBio)；Sirt1抗体、GAPDH抗体(Santa Cruz)；Bcl-2抗体(Bioss)；低温高速离心机(Eppendorf)；DNA扩增仪(Biometra)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 C57BL/6J小鼠膝关节软骨细胞的分离、纯化、培养和刺激处理：无菌操作下取小鼠双膝关节，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗，剪取全部膝关节软骨。在显微镜下去除关节囊周围组织，并将软骨组织与深层组织仔细分离。剪碎软骨组织后用0.2%II型胶原酶消化4～6 h，离心去上清，培养基洗涤后再用含15%胎牛血清培养液分散培养。随机分为两组，正常对照组与IL-1β组，IL-1β终浓度为100 ng/ml，继续培养，在加入IL-1β后24 h进行观察和检测。

    1.2.2 DAPI染色与流式细胞术观察软骨细胞凋亡：取第2代软骨细胞，调整密度为2×105/ml，接种于6孔板进行爬片。IL-1β组和对照组分别干预，24 h后按照DAPI染色试剂盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒说明书操作，观察细胞凋亡情况。

    1.2.3 荧光素酶报告基因实验验证：分别构建包含miR-34a种子序列结合位点野生型质粒、包含种子序列突变位点的突变型质粒(pmir-Glo-SIRT1-3’UTR WT和Mut) ......