程实 应金威 文天用 裴世深 苏凌浩 王德利 阮狄克**

    (1.海军总医院骨科，北京 100048；2.北京大学深圳医院骨关节科，广东 深圳 518035)

    椎间盘退行性疾病是引起临床下腰痛症状的重要病因之一，多种因素在椎间盘退变的过程中发挥作用[1]。目前认为椎间盘退变始于髓核，髓核细胞数量减少及功能失调是导致椎间盘退变的重要原因之一[2]，因此多数研究也都围绕髓核展开。在各种针对椎间盘退变的生物学治疗手段中，间充质干细胞因其具有自我复制和多系分化能力而在椎间盘退变修复中显示出巨大的应用潜力[3,4]。近年研究[5,6]发现，髓核组织内存在髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPSCs)，并且在维持髓核组织正常功能及内环境稳态中发挥重要作用。研究[7]发现，退变及衰老个体的椎间盘内髓核间充质干细胞分化能力减弱，无法继续发挥作用。因此，通过激活NPSCs向类髓核细胞分化以达到组织的自我修复是理想的治疗方法。骨形态生成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)都可以促进干细胞表达软骨相关基因，在调控干细胞向类软骨细胞分化及代谢中具有重要作用[8,9]。目前关于两者对于诱导NPSCs向类髓核细胞分化的作用及其最佳条件的报道较为少见。本实验旨在研究联合应用BMP-2和TGF-β3对NPSCs向类髓核细胞分化的作用，为进一步应用NPSCs修复椎间盘退变打下基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物来源

    3月龄健康雄性SD大鼠10只，体质量约330～350 g，均由海军总医院动物实验中心提供，动物处理方案符合伦理要求。

    1.2 髓核间充质干细胞的分离、培养及鉴定

    经腹腔过量注射10%水合氯醛处死SD大鼠，70%酒精浸泡消毒后切除鼠尾，无菌刀片切开纤维环，显微镜下分离髓核组织，转移至15 ml离心管中，加PBS漂洗3次去除血污，于六孔板内将髓核组织切成1 mm3的小块，加入2 mlⅡ型胶原酶消化4 h，终止消化，离心后将细胞转移至25 cm2培养瓶中 ......