张卫飞 孙军营 王方曦 李国庆 康斌 王德利 曾晖

    (骨科生物材料国家地方联合工程研究中心，北京大学深圳医院骨关节科，广东深圳 518036)

    关节软骨损伤是由于各种原因引起的关节透明软骨的缺损，因关节软骨缺乏淋巴和血管，因此自身的修复能力有限[1,2]。Curl等[3]回顾了31516例膝关节镜检查情况，发现63%患者存在膝关节软骨损伤。正常关节面有透明软骨覆盖，一旦损伤透明软骨，会引起关节的疼痛、不稳和僵硬，加速关节退变，导致骨关节炎的发生[4,5]。

    人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)是一类具有强大的自我更新能力、多向分化潜能的细胞。近年来，随着对hMSCs 和基因治疗研究的不断地深入，经基因修饰的hMSCs 以良好的增殖能力、安全而可控的定向成软骨细胞分化在软骨损伤修复中展现出重要的价值和诱人的应用前景[6-9]。

    Kormish 等[10]发现，Wnt/β-catenin 信号通路直接影响hMSCs 向软骨细胞分化的过程，促进hMSCs 的自我更新，抑制其向软骨细胞和脂肪细胞分化，而使其向成骨细胞分化的作用。Bi 等[11]在研究小鼠嵌合体模型时证实，Sox9基因敲除(Sox9-/-)的间充质细胞或胚胎干细胞经过诱导不会表达软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原α1 链基因(Col2αl)、Col9α2、Col11α2和ACAN，推断Sox9是软骨形成中最关键的基因。

    因此，β-catenin基因抑制hMSCs 成软骨分化，Sox9基因促进hMSCs 成软骨分化。但两者联合在hMSCs 早期成软骨分化中的作用尚不明确。本研究拟通过将β-catenin基因敲减与Sox9基因过表达的腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)一起转染进hMSCs 成软骨分化培养，与单独的β-catenin基因敲减组及Sox9基因过表达组的成软骨指标进行比较，探究β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合对hMSCs早期成软骨分化的作用。

    1 材料与方法

    1.1 试验设计

    故本研究通过腺相关病毒将β-catenin基因敲减与Sox9过表达转染进hMSCs，转染24 h 后通过RTPCR检测基因的转染效率，之后成软骨分化培养7 d，通过番红固绿染色和甲苯胺蓝染色检测软骨细胞基质，通过RT-PCR 检测COL2A1 和ACAN 的mRNA 表达量，通过免疫细胞化学检测COL2A1和Aggrecan的蛋白表达量 ......