熊翱，熊仁平，彭艳，黄治中，陈惺，江旭，曹福洋，许建中

    原代细胞培养技术是广泛应用于疾病体外研究的重要方法之一[1,2]，对原代培养的细胞进行分子生物学研究，可以排除其他细胞干扰，提高生物信息的准确性和特异性，进一步保证研究结论的可靠性。但原代细胞培养成功率低，有时纯度达标困难。解决了纯度问题，又会出现可用于实验研究材料的原代细胞的代数不多，仅2～3代可用[3,4]，传至4代以后的细胞就老化的问题，不能保持原代细胞原有的特征和功能。

    采用传代的原代细胞培养进行体外分子生物学研究，必须保证传代细胞具有原有细胞的生物学行为；确保原代培养体系的细胞健康状况良好；确保传代细胞的任一组分功能与原有细胞都无差异。原代细胞的分子生物学研究中，核酸(RNA、DNA)和蛋白质一直是其研究的主要内容。以往国内研究人员从原代培养细胞中提取RNA和蛋白质，都是参考国内外文献[5-7]，分别从原代培养细胞中提取。这样提取RNA和蛋白质费时费力，更突出的缺点是浪费资源(需两份培养细胞)、花费更多的经费(试剂重复使用)、操作繁锁(易受外界RNA酶污染)、延长研究周期[8-10]。这就使原代培养细胞实验研究工作的进展慢，不利于研究工作的顺利开展。因此，如何对培养的可用于实验研究的原代细胞做到物尽其用，从而节约经费、降低劳动成本、缩短研究周期是亟待解决的问题。

    本研究为了最大限度地发挥原代细胞的作用，在成功培养Sprague-Dawley(SD)大鼠原代滑膜细胞的基础上，探讨从原代培养的具有滑膜主要功能细胞之称的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)[11,12]中同时提取微量总RNA 和蛋白质。同时运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)方法检测滑膜原代FLS 的特征因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的mRNA 和蛋白质表达情况，同时与传统的分别提取微量总RNA和蛋白质的IL-1β 和TNF-α 的基因和蛋白质表达情况进行比较，探讨同时从一份原代培养细胞中提取微量总RNA和蛋白质的可能性。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    两月龄SPF 级雄性SD 大鼠，200～240 g，购于陆军军医大学陆军特色医学中心实验动物中心[SCXK(军)2017-0026]，饲养于陆军军医大学陆军特色医学中心实验动物中心[SYXK(军)2017-0058] ......