ERp29在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义(1)
【摘 要】目的：研究内质网分子伴侣29(ERp29)在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法：应用组织芯片技术与免疫组织化学染色相结合的方法检测90例卵巢癌组织，60例交界性卵巢肿瘤组织和30例卵巢良性肿瘤组织中ERp29的表达。结果：ERp29在卵巢癌中的阳性表达率为43.33%，低于良性肿瘤和交界性肿瘤的86.67%和73.33%，差异具有统计学意义(P<0.01)，且与肿瘤的临床分期和淋巴结的转移有关(P<0.05)，而与分化程度无关(P>0.05)。结论：ERp29有可能在卵巢上皮性肿瘤的侵袭和转移中起重要作用，可作为判断卵巢上皮性肿瘤恶性程度和预后的一个良好指标。
【关键词】卵巢上皮性肿瘤；内质网分子伴侣29；组织芯片；免疫组织化学
卵巢是人类发生肿瘤类型最多的器官，发病率逐年上升，已对妇女的健康构成严重威胁。上皮性肿瘤为卵巢肿瘤中最多的一大类，约占卵巢原发肿瘤的2/3，占卵巢原发恶性肿瘤的85%以上。卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率居生殖系统恶性肿瘤之首，并且有逐年上升的趋势。卵巢癌的侵袭和转移是一个涉及多因素、多阶段、多基因变异的复杂过程，具体机制尚不十分清楚。近年来研究证实内质网分子伴侣29(ERp29)在胃癌、食道癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等多种上皮性肿瘤中表达异常，并与肿瘤的分期、淋巴结转移及预后相关。本研究通过免疫组织化学SP法检测ERp29在不同卵巢上皮肿瘤中的表达情况，探讨其与卵巢上皮性肿瘤的发生、侵袭和转移的关系，以期对卵巢癌患者的预后判断和治疗提供有价值的理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
90例卵巢原发性上皮性恶性肿瘤均取自唐山工人医院病理科2009年1月至2013年12月间送检的手术标本。按WHO分类标准进行肿瘤分型，浆液性腺癌58例，粘液性癌19例，子宫内膜样腺癌7例，透明细胞癌6例。按国际抗癌联盟(FIGO)标准进行分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期45例、Ⅳ期6例。按肿瘤细胞的分化程度，高、中分化37例，低分化53例。其中41例发生淋巴结转移。年龄29～76岁，平均年龄54岁。良性病变组包括20例粘液性囊腺瘤和10例浆液性囊腺瘤。交界性病变组为40例卵巢交界性粘液性囊腺瘤和20例交界性浆液性囊腺瘤。所有病例术前均未采用放疗、化疗及内分泌治疗。术后均经病理检查确诊。
1.2 主要试剂
内质网分子伴侣29(ERp29)单克隆抗体购自Abcam公司。HRP-Polymer抗羊IgG(PV-9003)、二步法免疫组化试剂盒PV-9000、DAB及枸橼酸盐均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 方法
采用PV-9000二步法免疫组化检测系统，具体实验步骤参照北京中杉二步法免疫组化试剂盒PV-9000说明书进行。
1.4 结果判定
ERp29阳性部位集中于细胞质，呈棕黄色颗粒。采用阳性细胞百分比法进行半定量分析：计数100个细胞呈现的阳性细胞数，结合显色强弱分别为：阴性(-)不显色，弱阳性(+)<25%，中度阳性(++)26%～50%，强阳性(+++)>50%。
1.5 统计方法
Excell建立数据库，运用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，计数资料应用χ2检验。
2 结果
2.1 ERp29的蛋白表达
ERp29在卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤和卵巢癌中均有表达，且阳性表达率逐渐降低，在卵巢癌组织中表达率最低，仅为43.33%，而在良性肿瘤和交界性肿瘤中的表达率分别为86.67%和73.33%。ERp29在卵巢癌组织中的表达率与良性肿瘤组和交界性肿瘤组分别比较，P值均小于0.01，差异有统计学意义，良性肿瘤组和交界性肿瘤组相比较(P>0.05)差异不明显，无统计学意义(见表1)。
2.2 ERp29蛋白在卵巢癌中的表达与临床病理参数的关系
ERp29的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结的转移情况有关，在进展晚期(Ⅲ、Ⅳ期)和有淋巴结转移的癌组织中，ERp29的阳性表达率为35.29%和33.33%，分别低于早期(Ⅰ、Ⅱ期)和无淋巴结转移的癌组织中的58.97%和56.10%(P<0.05)，差异有统计学意义。高 、中分化组与低分化组比较，差异不明显(P>0.05)，无统计学意义(见表2)。
3 讨论
ERp29是一种ER管腔蛋白，分子量为29kDa，有蛋白质折叠和分泌的作用，具有2个结构域：N-端结构域和C-端结构域，其中N-端结构域与蛋白二硫键异构酶的硫氧还原蛋白结构类似，但缺乏Cys-X-X-Cys结构，不能与硫氧还原蛋白结合，因此没有PDI类似的氧化还原作用。C-端结构域为全螺旋结构，其中含有靶向内质网内腔的4肽内质网回收信号序列(KEEL)，与PDI的p5亚族相似。两结构域之间是自由转动的寡氨基酸链。ERp29和其他内质网蛋白一样广泛表达于各种组织，特别是在分泌旺盛的器官，如脑、垂体、甲状腺、肺、肝、肾上腺、睾丸及前列腺等分布较多，而在心肌和骨骼肌分布很少。ERp29作为一个新的辅助蛋白折叠/分泌的内质网蛋白，可协助甲状腺球蛋白及其它蛋白转运至细胞外，但不同于传统的分子伴侣，不能与ATP结合，亦不能与Ca2+结合[1]。
ERp29在肿瘤发生、发展中的作用尚不清楚，实验结果也不一致。Myung[2]及Cheretis[3]的研究结果发现ERp29高表达于原发肿瘤及癌细胞株，并与肿瘤生长相关。然而大多数的研究却发现ERp29表达与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及预后呈负相关。BambangIF[4]及GaoD[5]等研究发现，与非癌组织相比，乳腺癌组织中ERp29表达下降，并与肿瘤的侵袭相关。机制可能为乳腺癌细胞MDA-MB-231过表达ERp29后，致细胞周期停滞与G0/G1期，并抑制细胞增殖，细胞发生表型改变，及间质-上皮转化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)，表现为细胞骨架重组，压力纤维损失，纤维蛋白下降，上皮细胞标志物细胞角蛋白19和E-cadherin活化，间质细胞标志物vimentin丧失，细胞侵袭/转移能力下降。唐卫文等[6]的研究发现ERp29在食道癌旁组织呈高表达，而在食道癌组织中表达明显下降。桑旭等[7]的研究发现ERp29在胃癌旁组织呈高表达，而在胃癌组织中表达明显下降。以上研究均表明ERp29是一个潜在的抑癌基因。, 百拇医药(夏庆安 付玉环)
【关键词】卵巢上皮性肿瘤；内质网分子伴侣29；组织芯片；免疫组织化学
卵巢是人类发生肿瘤类型最多的器官，发病率逐年上升，已对妇女的健康构成严重威胁。上皮性肿瘤为卵巢肿瘤中最多的一大类，约占卵巢原发肿瘤的2/3，占卵巢原发恶性肿瘤的85%以上。卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率居生殖系统恶性肿瘤之首，并且有逐年上升的趋势。卵巢癌的侵袭和转移是一个涉及多因素、多阶段、多基因变异的复杂过程，具体机制尚不十分清楚。近年来研究证实内质网分子伴侣29(ERp29)在胃癌、食道癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等多种上皮性肿瘤中表达异常，并与肿瘤的分期、淋巴结转移及预后相关。本研究通过免疫组织化学SP法检测ERp29在不同卵巢上皮肿瘤中的表达情况，探讨其与卵巢上皮性肿瘤的发生、侵袭和转移的关系，以期对卵巢癌患者的预后判断和治疗提供有价值的理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
90例卵巢原发性上皮性恶性肿瘤均取自唐山工人医院病理科2009年1月至2013年12月间送检的手术标本。按WHO分类标准进行肿瘤分型，浆液性腺癌58例，粘液性癌19例，子宫内膜样腺癌7例，透明细胞癌6例。按国际抗癌联盟(FIGO)标准进行分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期45例、Ⅳ期6例。按肿瘤细胞的分化程度，高、中分化37例，低分化53例。其中41例发生淋巴结转移。年龄29～76岁，平均年龄54岁。良性病变组包括20例粘液性囊腺瘤和10例浆液性囊腺瘤。交界性病变组为40例卵巢交界性粘液性囊腺瘤和20例交界性浆液性囊腺瘤。所有病例术前均未采用放疗、化疗及内分泌治疗。术后均经病理检查确诊。
1.2 主要试剂
内质网分子伴侣29(ERp29)单克隆抗体购自Abcam公司。HRP-Polymer抗羊IgG(PV-9003)、二步法免疫组化试剂盒PV-9000、DAB及枸橼酸盐均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 方法
采用PV-9000二步法免疫组化检测系统，具体实验步骤参照北京中杉二步法免疫组化试剂盒PV-9000说明书进行。
1.4 结果判定
ERp29阳性部位集中于细胞质，呈棕黄色颗粒。采用阳性细胞百分比法进行半定量分析：计数100个细胞呈现的阳性细胞数，结合显色强弱分别为：阴性(-)不显色，弱阳性(+)<25%，中度阳性(++)26%～50%，强阳性(+++)>50%。
1.5 统计方法
Excell建立数据库，运用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，计数资料应用χ2检验。
2 结果
2.1 ERp29的蛋白表达
ERp29在卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤和卵巢癌中均有表达，且阳性表达率逐渐降低，在卵巢癌组织中表达率最低，仅为43.33%，而在良性肿瘤和交界性肿瘤中的表达率分别为86.67%和73.33%。ERp29在卵巢癌组织中的表达率与良性肿瘤组和交界性肿瘤组分别比较，P值均小于0.01，差异有统计学意义，良性肿瘤组和交界性肿瘤组相比较(P>0.05)差异不明显，无统计学意义(见表1)。
2.2 ERp29蛋白在卵巢癌中的表达与临床病理参数的关系
ERp29的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结的转移情况有关，在进展晚期(Ⅲ、Ⅳ期)和有淋巴结转移的癌组织中，ERp29的阳性表达率为35.29%和33.33%，分别低于早期(Ⅰ、Ⅱ期)和无淋巴结转移的癌组织中的58.97%和56.10%(P<0.05)，差异有统计学意义。高 、中分化组与低分化组比较，差异不明显(P>0.05)，无统计学意义(见表2)。
3 讨论
ERp29是一种ER管腔蛋白，分子量为29kDa，有蛋白质折叠和分泌的作用，具有2个结构域：N-端结构域和C-端结构域，其中N-端结构域与蛋白二硫键异构酶的硫氧还原蛋白结构类似，但缺乏Cys-X-X-Cys结构，不能与硫氧还原蛋白结合，因此没有PDI类似的氧化还原作用。C-端结构域为全螺旋结构，其中含有靶向内质网内腔的4肽内质网回收信号序列(KEEL)，与PDI的p5亚族相似。两结构域之间是自由转动的寡氨基酸链。ERp29和其他内质网蛋白一样广泛表达于各种组织，特别是在分泌旺盛的器官，如脑、垂体、甲状腺、肺、肝、肾上腺、睾丸及前列腺等分布较多，而在心肌和骨骼肌分布很少。ERp29作为一个新的辅助蛋白折叠/分泌的内质网蛋白，可协助甲状腺球蛋白及其它蛋白转运至细胞外，但不同于传统的分子伴侣，不能与ATP结合，亦不能与Ca2+结合[1]。
ERp29在肿瘤发生、发展中的作用尚不清楚，实验结果也不一致。Myung[2]及Cheretis[3]的研究结果发现ERp29高表达于原发肿瘤及癌细胞株，并与肿瘤生长相关。然而大多数的研究却发现ERp29表达与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及预后呈负相关。BambangIF[4]及GaoD[5]等研究发现，与非癌组织相比，乳腺癌组织中ERp29表达下降，并与肿瘤的侵袭相关。机制可能为乳腺癌细胞MDA-MB-231过表达ERp29后，致细胞周期停滞与G0/G1期，并抑制细胞增殖，细胞发生表型改变，及间质-上皮转化(mesenchymal-epithelialtransition，MET)，表现为细胞骨架重组，压力纤维损失，纤维蛋白下降，上皮细胞标志物细胞角蛋白19和E-cadherin活化，间质细胞标志物vimentin丧失，细胞侵袭/转移能力下降。唐卫文等[6]的研究发现ERp29在食道癌旁组织呈高表达，而在食道癌组织中表达明显下降。桑旭等[7]的研究发现ERp29在胃癌旁组织呈高表达，而在胃癌组织中表达明显下降。以上研究均表明ERp29是一个潜在的抑癌基因。, 百拇医药(夏庆安 付玉环)