高效液相色谱法测定氨甲苯酸注射液的含量及有关物质
【摘 要】目的：观察高效液相色谱法在氨甲苯酸注射液的含量及有关物质的测定中的应用效果。方法：色谱柱：使用氨基键合硅胶柱(Boston Green Amino-NH2，规格设定：4.6mm×250mm，5μm) ；流动相：乙腈和醋酸钠的混合溶液，醋酸钠浓度为0.04%，二者比例70：30，加入氢氧化钠PH值调节至7.4。检测波长：235nm；流速：1.00ml/min；进样量：10μl；柱温：30℃。结果：此色谱条件下，在0.026～0.041mg·ml-1的范围内，氨甲苯酸具有较好的线性关系，(r=0.999)；平均回收率达到100.20%；RSD为0.6%(n=9)。结论：高效液相色谱法测定氨甲苯酸的含量和有关物质，操作简单、快速，且准确性高、重现性好，能够作为氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸含量及有关物质测定的有效方法，提供科学的临床参考。
【关键词】高效液相色谱法；氨甲苯酸注射液；含量；有关物质；测定
氨甲苯酸，属于抗纤溶止血药中的一种，临床应用方向主要治疗由原发性纤维蛋白溶解过渡而造成的出血症，广泛应用与急慢性、全身性或者局部性的高纤维出血症状[1]。为实现对其质量的更好控制，本文采取高效液相色谱法对氨甲苯酸注射液的含量和有关物质进行测定，以期提供临床参考依据。
1 仪器及试药
1.1仪器
岛津LC-10AD高效液相色谱仪(型号：LC-10A)，系统组成：LC-10ADvp溶剂输送泵，在线脱气机，FCV-10AL低压梯度混合器，SPD-10Avp紫外-可见检测器，Rheodyne7725i手动进样阀，N200色谱数据工作站。FA1004N电子分析天平。
1.2试药
氨甲苯酸对照样品(中检所提供，产品批号为100174-200402，含量：100.00%)；氨甲苯酸注射液样品，共4批，批号如下：样品1：1061226，样品2：1052018；样品3：1052021；样品4：1061228。乙腈：色谱纯；醋酸钠：分析纯；水：超纯水。
2 方法及结果
2.1制备溶液
(1)對照品溶液：精密称取10.00mg的氨甲苯酸对照样品，以100ml量瓶盛装，加水摇匀稀释，稀释后溶液浓度为0.1mg·ml-1。
(2)供试品溶液：精密称取2ml氨甲苯酸注射液样品，先以50ml量瓶盛装，加水稀释至刻度，从稀释液中精密量取5ml，以20ml量瓶盛装，加水摇匀稀释至刻度，稀释后溶液浓度为0.1mg·ml-1[2]。
(3)阴性对照溶液：取10.00mg空白辅料，以100ml量瓶盛装，加水稀释至刻度，摇匀并过滤后，取续滤液[3]。
2.2色谱条件及系统适用性
色谱柱：使用氨基键合硅胶柱(Boston Green Amino-NH2，规格设定：4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈和醋酸钠的混合溶液，醋酸钠浓度为0.04%，二者比例70：30，加入氢氧化钠PH值调节至7.4。检测波长：235nm；流速：1.00ml/min；进样量：10μl；柱温：30℃。按氨甲苯酸峰计，理论板数≥1000。
2.3线性范围
精密称取适量对照样品，加水稀释并摇匀(2mg·ml-1)，精密量取3ml、5ml、5ml、10ml、20ml，分别以200ml、200ml、100ml、100ml、100ml量瓶盛装并稀释至刻度，各样品量取10μl，加入液相色谱仪，进行回归分析，得方程A=4.172104C-2.755，r=0.999，结果显示，在0.026～0.041mg·ml-1的范围内，氨甲苯酸具有较好的线性关系。
2.4重复性试验
按上述方法制备6份溶液并测定，平均结果为100.5%，RSD为0.65%(n=6)提示这一测定方法重复性较高。
2.5回收试验
取9份供试品，分别以50ml的量瓶盛装，加水稀释至刻度作为贮备液。精密量取5ml贮备液，以25ml量瓶盛装，以标示量的80%、100%与120%，加入适量氨甲苯酸对照样品，加水稀释至刻度。在试验色谱条件下，计算回收率。结果表明，这一测定方法具有良好的回收率。
2.6有关物质测定
取适量氨甲苯酸注射液，以流动相溶解为4mg：1ml溶液，精密量取适量，以流动相溶解为0.4mg：1ml溶液①；溶液②10μg：1ml；溶液③4μg：1ml。
取20μl溶液②注入液相色谱仪，调节主成份色谱峰的峰高至满标度的80%，各取溶液①、③20μl进样。记录色谱图至主成份峰保留时间的2倍。若溶液①有杂质峰，除溶液峰外，量取的各杂质峰面积和，应小于溶液③主峰面积[4]。各样品有关物质含量分别是0.111%、0.113%、0.118%、0.114%。
3 讨论
3.1选择检测波长
取适量氨甲苯酸对照样品，加流动相稀释后，在200～380nm范围行紫外扫描，在235nm处吸收最大，遂点定波长为235nm。
3.2选择流动相
选取比例不同的水相及有机相进行实验，结果显示，以乙腈和醋酸钠的混合溶液(醋酸钠浓度为0.04%，二者比例70：30，加入氢氧化钠PH值调节至7.4)为流动相时，其出峰时间与峰形与主峰相符合，因此选为流动相。
3.3选择色谱柱
氨甲苯酸是极性药物，考虑相似相溶原理，在选取色谱柱时，应该选取非极性色谱柱，因此，为保证更好的物质分离效果，选择氨基柱。
3.4选择溶剂
根据氨甲苯酸的化学特性，我们知道，氨甲苯酸会溶于沸水，在水中微溶，而在乙醇、乙醚、氯仿或本当中，则不会溶解，本研究结合以往的实践研究经验，为保证实验效果，最终决定用纯水作为溶剂，结果显示，主峰与辅料峰和溶剂峰的分离效果完好。
在现行的氨甲苯酸注射液的质量标准中，进行含量测定时，采取容量分析法，但是该法操作复杂，步骤繁琐，还易于出现操作失误，实践应用效果受限。本研究采用高翔液相色谱法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸及有关物质的测定，快捷准确，操作简便且专属性强，值得推广应用。
参考文献：
[1]黄小琴，吴珺.HPLC法测定注射用氨甲环酸中氨甲环酸的含量[J].海峡药学，2013，25(9)：106-108.
[2]郭旭光，郭兴辉.HPLC法测定氨甲苯酸注射液的含量及有关物质[J].安徽医药，2012，16(8)：1084-1086.
[3]韩淑芹.HPLC法测定亚甲蓝注射液含量及其有关物质[J].中国药师，2016，19(4)：811-813.
[4]朱迎军，兰文，王伟娇.高效液相色谱法测定氨甲苯酸注射液的含量及有关物质[J].中南药学，2012，10(4)：263-265., 百拇医药(夏月丽 徐菊英)
【关键词】高效液相色谱法；氨甲苯酸注射液；含量；有关物质；测定
氨甲苯酸，属于抗纤溶止血药中的一种，临床应用方向主要治疗由原发性纤维蛋白溶解过渡而造成的出血症，广泛应用与急慢性、全身性或者局部性的高纤维出血症状[1]。为实现对其质量的更好控制，本文采取高效液相色谱法对氨甲苯酸注射液的含量和有关物质进行测定，以期提供临床参考依据。
1 仪器及试药
1.1仪器
岛津LC-10AD高效液相色谱仪(型号：LC-10A)，系统组成：LC-10ADvp溶剂输送泵，在线脱气机，FCV-10AL低压梯度混合器，SPD-10Avp紫外-可见检测器，Rheodyne7725i手动进样阀，N200色谱数据工作站。FA1004N电子分析天平。
1.2试药
氨甲苯酸对照样品(中检所提供，产品批号为100174-200402，含量：100.00%)；氨甲苯酸注射液样品，共4批，批号如下：样品1：1061226，样品2：1052018；样品3：1052021；样品4：1061228。乙腈：色谱纯；醋酸钠：分析纯；水：超纯水。
2 方法及结果
2.1制备溶液
(1)對照品溶液：精密称取10.00mg的氨甲苯酸对照样品，以100ml量瓶盛装，加水摇匀稀释，稀释后溶液浓度为0.1mg·ml-1。
(2)供试品溶液：精密称取2ml氨甲苯酸注射液样品，先以50ml量瓶盛装，加水稀释至刻度，从稀释液中精密量取5ml，以20ml量瓶盛装，加水摇匀稀释至刻度，稀释后溶液浓度为0.1mg·ml-1[2]。
(3)阴性对照溶液：取10.00mg空白辅料，以100ml量瓶盛装，加水稀释至刻度，摇匀并过滤后，取续滤液[3]。
2.2色谱条件及系统适用性
色谱柱：使用氨基键合硅胶柱(Boston Green Amino-NH2，规格设定：4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈和醋酸钠的混合溶液，醋酸钠浓度为0.04%，二者比例70：30，加入氢氧化钠PH值调节至7.4。检测波长：235nm；流速：1.00ml/min；进样量：10μl；柱温：30℃。按氨甲苯酸峰计，理论板数≥1000。
2.3线性范围
精密称取适量对照样品，加水稀释并摇匀(2mg·ml-1)，精密量取3ml、5ml、5ml、10ml、20ml，分别以200ml、200ml、100ml、100ml、100ml量瓶盛装并稀释至刻度，各样品量取10μl，加入液相色谱仪，进行回归分析，得方程A=4.172104C-2.755，r=0.999，结果显示，在0.026～0.041mg·ml-1的范围内，氨甲苯酸具有较好的线性关系。
2.4重复性试验
按上述方法制备6份溶液并测定，平均结果为100.5%，RSD为0.65%(n=6)提示这一测定方法重复性较高。
2.5回收试验
取9份供试品，分别以50ml的量瓶盛装，加水稀释至刻度作为贮备液。精密量取5ml贮备液，以25ml量瓶盛装，以标示量的80%、100%与120%，加入适量氨甲苯酸对照样品，加水稀释至刻度。在试验色谱条件下，计算回收率。结果表明，这一测定方法具有良好的回收率。
2.6有关物质测定
取适量氨甲苯酸注射液，以流动相溶解为4mg：1ml溶液，精密量取适量，以流动相溶解为0.4mg：1ml溶液①；溶液②10μg：1ml；溶液③4μg：1ml。
取20μl溶液②注入液相色谱仪，调节主成份色谱峰的峰高至满标度的80%，各取溶液①、③20μl进样。记录色谱图至主成份峰保留时间的2倍。若溶液①有杂质峰，除溶液峰外，量取的各杂质峰面积和，应小于溶液③主峰面积[4]。各样品有关物质含量分别是0.111%、0.113%、0.118%、0.114%。
3 讨论
3.1选择检测波长
取适量氨甲苯酸对照样品，加流动相稀释后，在200～380nm范围行紫外扫描，在235nm处吸收最大，遂点定波长为235nm。
3.2选择流动相
选取比例不同的水相及有机相进行实验，结果显示，以乙腈和醋酸钠的混合溶液(醋酸钠浓度为0.04%，二者比例70：30，加入氢氧化钠PH值调节至7.4)为流动相时，其出峰时间与峰形与主峰相符合，因此选为流动相。
3.3选择色谱柱
氨甲苯酸是极性药物，考虑相似相溶原理，在选取色谱柱时，应该选取非极性色谱柱，因此，为保证更好的物质分离效果，选择氨基柱。
3.4选择溶剂
根据氨甲苯酸的化学特性，我们知道，氨甲苯酸会溶于沸水，在水中微溶，而在乙醇、乙醚、氯仿或本当中，则不会溶解，本研究结合以往的实践研究经验，为保证实验效果，最终决定用纯水作为溶剂，结果显示，主峰与辅料峰和溶剂峰的分离效果完好。
在现行的氨甲苯酸注射液的质量标准中，进行含量测定时，采取容量分析法，但是该法操作复杂，步骤繁琐，还易于出现操作失误，实践应用效果受限。本研究采用高翔液相色谱法测定氨甲苯酸注射液中氨甲苯酸及有关物质的测定，快捷准确，操作简便且专属性强，值得推广应用。
参考文献：
[1]黄小琴，吴珺.HPLC法测定注射用氨甲环酸中氨甲环酸的含量[J].海峡药学，2013，25(9)：106-108.
[2]郭旭光，郭兴辉.HPLC法测定氨甲苯酸注射液的含量及有关物质[J].安徽医药，2012，16(8)：1084-1086.
[3]韩淑芹.HPLC法测定亚甲蓝注射液含量及其有关物质[J].中国药师，2016，19(4)：811-813.
[4]朱迎军，兰文，王伟娇.高效液相色谱法测定氨甲苯酸注射液的含量及有关物质[J].中南药学，2012，10(4)：263-265., 百拇医药(夏月丽 徐菊英)