刘 燕，朱吉海，孙 伟，赵 珺

    (1.青海大学医学院免疫学教研室；2.青海大学附属医院心胸外科)

    细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率的比较※

    刘 燕1，朱吉海2，孙 伟1，赵 珺1

    (1.青海大学医学院免疫学教研室；2.青海大学附属医院心胸外科)

    目的 比较细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率。方法 采用胃泌素特异干扰载体转染人胃癌原代细胞株L25，经G418抗性筛选获得混克隆和单克隆细胞，应用RT-PCR、Western blot和免疫荧光三种方法对混克隆细胞和单克隆细胞干扰胃泌素基因的效率进行比较。结果 RT-PCR结果显示混克隆细胞胃泌素mRNA表达水平被明显抑制。在挑取的10株单克隆细胞中，胃泌素的表达均受到干扰，其效果有差异，其中有2株单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10胃泌素mRNA表达水平抑制率达到86%，抑制效率与混克隆细胞相同，其他8株单克隆细胞的平均抑制率为31%。Western blot和免疫荧光结果均显示单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10与混克隆细胞在胃泌素蛋白水平的干扰效果相同。结论 采用混克隆细胞进行生物学特性鉴定和后续基因表达水平研究，实验信息量大、周期短、污染几率小、可重复性强，是一种省时、简便、高效的方法。

    混克隆细胞 单克隆细胞 干扰效率

    分子克隆实验中，经常需要把外源性的DNA通过载体导入细胞，以便进行基因功能、基因调控等方面的实验[1-3]。这些研究要求外源基因能够稳定整合到宿主染色体的细胞中，即我们所说的克隆化细胞[4-5]。以往常用的方法是选择性标记，将携带外源基因的载体加上neo抗性基因，用含G418的选择培养基筛选出有效表达外源基因的单克隆细胞[6-8]。但这种方法由于实验周期过长、不可控因素过多，往往鉴定不出有效的单克隆。本研究以干扰胃癌原代细胞株L25中胃泌素基因的表达为例，构建了带有neo抗性的胃泌素干扰载体(pshRNA-gast)，将其转染入L25细胞中，经G418抗性筛选建立稳定整合外源基因的混克隆细胞株和单克隆细胞株，应用RT-PCR、Western blot和免疫荧光法比较干扰胃泌素表达的单克隆与混克隆细胞中靶基因表达水平的差异，以明确是否有必要通过获得单克隆细胞进行后续研究。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    胃泌素干扰质粒pshRNA-gast及人胃癌原代细胞株由实验室自己构建；细胞培养用DMEM培养基、胎牛血清及胰酶购自美国Gibco公司；Trizol及LipofectamineTM2000试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及PCR 10×Mix试剂购自北京Transgen公司；Gastrin抗体购自英国Abcam公司；二抗购自美国Santa cruz公司 ......