席孝忠,李国强,肖雷,姚坤厚

    (1 信阳市中心医院肿瘤外科,河南 信阳 464000；2 河南大学淮河医院普通外科)

    结肠癌是消化道癌症主要表型，其恶性程度较高[1]，病死率位居恶性肿瘤前列，且呈逐年上升趋势，地域和人群差异显著[2]。研究表明，肿瘤干细胞分离和鉴定极大地推动了实体肿瘤如肺癌、消化道癌、生殖系统癌症等的深入研究[3-5]。细胞表面标志物，如CD133、CD44等，已被广泛用于各类恶性肿瘤干细胞的鉴定，如消化道癌等[6]。此外，miRNA是一类可以通过阻断mRNA翻译或者降解目标mRNA，从而发挥基因抑制的内源性非编码的小RNA。miRNA异常表达已被证实与癌细胞增殖、凋亡及转移等关联密切，并参与恶性肿瘤进程，其中miR-21在结肠癌中高表达[7]。本研究基于生物学预测网站发现成纤维细胞生长因子18(FGF18)为促癌基因[8]，是miR-21-5p靶基因之一，然而有关其在结肠癌中的研究尚未见报道。基于此，本研究主要探究了miR-21-5p调控FGF18表达对结肠癌肿瘤干细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制。

    1 材料和方法

    1.1 实验材料

    结肠癌HT29细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所提供)；胰蛋白酶(Hyclone公司，USA)；DMEM/F12培养基(Gibco公司，USA)；细胞转染序列(上海奇骏牛物科技有限公司)；分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；倒置光学显微镜(宁波舜宇光学科技(集团)有限公司)；细胞凋亡检测试剂盒(Sigma公司，USA)；miR-21-5p、FGF18引物合成(Takara，大连宝生物工程有限公司)；荧光定量PCR仪(ABI，USA)；BCA试剂盒(广州威佳生物科技有限公司)；Western blotting试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。

    1.2 实验方法

    1.2.1CD133+/CD44+结肠癌干细胞分选 将结肠癌HT29细胞进行常规消化，参照既往文献的方法[9]，采用流式细胞分选技术分离筛选CD133+/CD44+结肠癌干细胞。将分选后细胞重悬，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下于6孔板中培养。以供后续细胞增殖、迁移和侵袭及凋亡等实验应用。

    1.2.2CD133+/CD44+细胞培养、分组及质粒转染观察CD133+/CD44+细胞的生长状况，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下继续培养。细胞传代培养过程中，对细胞进行离心和消化处理 ......