周宏稷,田惠,张蕊,常晓天,安毅

    (青岛大学附属医院心血管内科,山东 青岛 266003)

    细胞衰老和机体衰老存在因果关系，组织器官内衰老细胞聚集将影响机体正常的生物功能。因D-半乳糖(D-gal)致衰老模型构建简便，有较高可行性与稳定性，被广泛应用于基础实验中[1]。矢车菊素-3-O-葡萄糖(C3G)为普遍存在于自然界中的一种稳定的花青素,具有抗氧化、抗炎等作用[2]，对于延缓衰老具有重要意义[3]。但其是否能干预心肌衰老进程及机制犹未明确。研究发现C3G具有CD38抑制剂的作用[4]，而CD38的表达与衰老存在相关性[5]。CD38作为细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)主要的代谢酶，在与年龄相关的衰老伴随的NAD+衰退中起着核心作用[6]。前期研究发现，NK细胞中CD38高表达抑制了Sirtuin 6(Sirt6)的表达[7]。有研究显示，C3G参与影响Sirt6功能[8]，Sirt6通过沃伯格效应干预糖酵解酶的变化与衰老进程相关[9-10]。本研究拟采用C3G干预D-gal诱导的大鼠H9c2心肌细胞衰老模型,探讨C3G对心肌细胞衰老的影响及其机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    大鼠心肌细胞H9c2购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。C3G、D-gal(索莱宝,中国)；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(MCE，美国)； DMEM高糖培养液、胎牛血清(普诺赛公司,中国)；Annexin V-FITC / PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(Elabscience，中国)；细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒(碧云天，中国)；大鼠Sirt6、CD38、乳酸脱氢酶A(LDHA)、端粒酶逆转录酶(TERT)、己糖激酶Ⅱ(HK2)引物(生工，中国)； 氧化型辅酶Ⅰ/还原型辅酶Ⅰ(NAD+/NADH)检测试剂盒(碧云天，中国)；RNA iso Plus(Takara,日本)；HiScript Ⅲ RT SuperMix、SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞,中国)。

    1.2 D-gal与C3G最佳干预浓度筛选及实验分组

    H9c2细胞在含有体积分数0.10胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L链霉素的DMEM培养液中，37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后，分别用0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L浓度的D-gal处理48 h ......