綦英合,尹敏,刘桂波,李翠

    (青岛大学附属医院眼科,山东 青岛 266003)

    真菌性角膜炎(FK)是一种由病原真菌引起的顽固性角膜疾病,如果治疗不当会引起角膜溃疡、穿孔甚至失明[1]。由于工农业生产导致眼外伤、术后角膜感染、隐形眼镜的佩戴以及类固醇激素的滥用,FK的发病率越来越高[2]。FK的严重程度与真菌病原体的毒力和宿主防御机制密切相关[3]。一方面,真菌病原体的孢子侵入眼表,对角膜组织造成物理损伤,同时分泌毒力因子进一步破坏角膜结构[4];另一方面,真菌病原体侵入角膜会引发强烈的免疫反应,诱导免疫细胞积累,进一步促进促炎细胞因子的产生,导致角膜溃疡的延迟愈合[5]。因此,抗真菌联合抗炎治疗是快速改善FK的关键。最近,中药治疗真菌感染引起了国内外的广泛关注。薯蓣皂苷(DS)是一种从薯蓣、穿山龙、闭鞘姜等多种植物根茎中分离提取的天然化合物,具有毒性低、资源丰富等优点[6]。药理学研究证明DS具有抗肿瘤、抗炎、抗真菌和降血脂等多种药理作用[7-10]。有研究发现,DS通过破坏真菌细胞膜的完整性导致细胞内离子外流、细胞膜电位和细胞内渗透压发生改变,对白色念珠菌具有良好的抗菌活性[11],然而其是否对烟曲霉菌(AF)有作用目前尚不清楚。RAN等[12]研究显示,DS通过激活核因子-红细胞2相关因子2(Nrf2)信号通路,减少炎症细胞浸润,并抑制白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子的表达和分泌,从而改善炎症反应。本研究拟通过体内和体外实验探究DS在AF性角膜炎中的作用及其机制。

    1 材料与方法

    1.1 DS溶液的制备和AF培养

    用精密电子天平称量32 μg的DS加入至1 μL的DMSO中,然后用无菌PBS将该混合物稀释至1 mL,得到32 mg/L的 DS储存溶液,之后再用DMEM培养液将其稀释至所需浓度。参考相关文献的方法[13],将AF株(NO3.0772,中国北京微生物中心)接种于沙氏液体培养基中,37 ℃孵育48 h,收集菌丝洗涤、离心、弃上清,将部分真菌活菌丝用于动物实验;另一部分用体积分数0.75的乙醇处理作为灭活菌丝用于细胞实验。所有菌丝均用DMEM培养液和无菌PBS稀释至3×108CFU/L。

    1.2 细胞培养及处理

    将RAW264.7细胞(购自中国科学院上海细胞库)接种于12孔板中,在37 ℃、体积分数0.05 CO2的条件下进行培养,随机分为溶剂对照组(A组)、DS处理组(B组)、单纯加菌组(C组)和加菌DS处理组(D组),每组设置6个复孔 ......