鲁叶慧,栾军杰,刘星,吴瑗,林静

    (青岛大学附属医院眼科,山东 青岛 266003)

    真菌性角膜炎是一种严重的角膜感染性疾病,在亚洲和非洲等发展中国家发病率高[1]。丝状真菌如烟曲霉菌和镰刀菌是诱发真菌性角膜炎的主要原因,一旦其分生孢子透过角膜上皮进入到基质,孢子会迅速萌发,诱发症状。目前,真菌性角膜炎的一线治疗是局部使用那他霉素、伏立康唑、两性霉素B等药物[2],但这些药物存在水溶性差、渗透性差及严重的不良反应,因此亟待开发可用于临床的低毒高效的治疗药物。血根碱(SAN)为一种季铵盐类苯并菲啶生物碱,是来源于血根草、大白屈菜和博落回的一类重要的天然异喹啉生物碱[3-4]。 SAN具有多种药理活性,包括抗肿瘤、抗菌、抗炎和改善心血管功能等[5-9]。最近的研究显示,在大鼠的神经源性疼痛模型中,SAN可以通过抑制白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)等炎症因子的表达来减轻疼痛[10-12]。SAN在急、慢性炎症中发挥抗炎作用。但是SAN能否在真菌性角膜炎中发挥抗炎作用尚未见报道。本研究旨在探讨SAN对烟曲霉菌感染的巨噬细胞及小鼠角膜炎症的调节作用,为治疗真菌性角膜炎提供一种新思路。

    1 材料和方法

    1.1 实验材料

    小鼠来源的RAW264.7巨噬细胞系购于中国科学院细胞库(上海)。实验所用40只8周大小健康的C57BL/6雌鼠购于山东济南朋悦有限公司,体质量20～30 g,按照青岛大学附属医院动物委员会批准的方案饲养。SAN(100 mg,纯度98%)由麦克林试剂公司提供,用体积分数0.001的DMSO溶解后以2 g/L储备液-20 ℃储存;RNAex pro reagent裂解液(艾科瑞生物工程有限公司);酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(Biolegend公司);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天,中国);烟曲霉菌(CPCC 3.0772,中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京))。

    1.2 研究方法

    1.2.1烟曲霉菌丝制备 烟曲霉菌丝及灭活烟曲霉菌丝制备方法基于本实验室原有步骤,进行优化[13]。将烟曲霉标准菌株接种于酵母膏胨葡萄糖培养液(葡萄糖10 g、蛋白胨100 g、酵母5 g溶解于双蒸水中定容1 L),置35 ℃培养箱孵育4～7 d后于超净工作台研磨菌丝至20～30 μm大小,一半经3次离心后重悬,用DMEM稀释至1×1011CFU/L;另一半浸泡于体积分数0.75乙醇中,24 h后重复前述步骤,获得灭活烟曲霉菌用于后续实验 ......