朱 蓉，赵 逵，方兴国，狄连君，陈小燕

    (遵义医学院附属医院 消化内科， 贵州 遵义 563099)

    Achaete scute-like 2 (Ascl2)是一个与肠干细胞相关的重要转录因子，是Wnt信号途径的靶分子之一[1]，目前研究发现，Ascl2不仅控制成体肠干细胞的“命运”[2]：在小鼠肠上皮中转基因过表达Ascl2出现肠隐窝过度增生和肠绒毛异位隐窝出现，在成体小鼠肠道诱导Ascl2基因表达缺失导致Lgr5阳性的成体肠隐窝干细胞在数天后消失；而且，Ascl2还与结肠癌相关，其调控结肠癌干细胞“干性”[3-4]。本研究通过成功构建Ascl2的RNAi质粒，转染人结肠癌HT-29细胞，通过G418筛选、挑取克隆并扩增培养形成稳定转染的细胞系，再将该细胞移植到裸鼠皮下，并采用小动物活体成像仪观察Ascl2干扰前后HT-29细胞的致瘤能力，以探讨Ascl2-RNAi对结肠癌HT-29细胞体内生长增殖的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器 人结肠癌HT-29细胞株购自中科院上海细胞库(该细胞株引自ATCC)； 胎牛血清购自Hyclone公司；Macoy’s 5A培养基购自Sigma公司； LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；抗Ascl2单克隆抗体购自Millipore公司；激光共聚焦扫描显微镜购自德国 Carl Zeiss公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；小动物活体成像仪Maestro EX2.10(第三军医大学烧伤研究所)购自美国CRI。

    1.2 细胞培养、质粒构建以及稳定转染细胞系的建立

    1.2.1 细胞的传代培养 人结肠癌细胞株HT-29培养于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A完全培养液中，置于37℃，5% CO2的培养箱中，每2～3天换液1次，细胞生长融合至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液进行消化，传代培养。

    1.2.2 质粒构建与测序 对照质粒shRNA-control/EGFP以及shRNA-Ascl2/EGFP质粒均由武汉市晶赛生物工程有限公司合成，经文献查得Ascl2干扰片段的序列为CCGCGTGAAGCTGGTGAAC[2 ]，由此设计合成的DNA模板引物为：

    5’-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3', ......