李永菊，周 涯，陈 超，朱顺飞，胡 燕，秦娜琳，郑 静，徐 林

    (1.遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 医学物理学教研室，贵州 遵义 563099)

    微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是新近报道的miRNA家族成员，定位于第15号染色体，已有的研究显示其可以广泛参与调节机体生物学活动和临床相关疾病的发生过程，但其在机体整体水平的生物学功能仍待深入研究阐明[1-2]。我们设想通过建立miR-7基因敲减小鼠，以研究动物整体的miR-7抑制后，对机体生物学功能的潜在影响。本文拟构建转基因用的真核表达载体pG-miR-7-Sponge，并通过转染95D细胞鉴定其表达活性，以验证该载体用于下一步miR-7基因敲减小鼠建立的可行性。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人源性肺巨细胞癌细胞株95D，由本实验室保存。限制性内切酶HindⅢ与KpnI和T4 DNA连接酶购自Thermo公司；Stbl3感受态细胞由本实验室保存；质粒抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；MTT、DMSO试剂购自Sigma公司；RPMI 1640培养基购自Hyclone公司；优质胎牛血清购自Solarbio公司；SYBR Premix Ex Taq real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司；eGFP-C2真核表达载体和LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；分析纯级异丙醇、无水乙醇、甲醛、结晶紫购自重庆川东化工；生化培养基购自苏州净化设备厂；二氧化碳培养箱购自Thermo公司；C1000TM Thermal Cycler Real-Time PCR仪、S1000TM Thermal cycler PCR 仪购自Bio-Rad 公司；TD5A-WS台式低速离心机购自湘仪仪器公司；IX-51倒置显微镜、IX-71倒置荧光显微镜购自OLYMPUS公司；DNA合成由赛业生物科技有限公司完成和测序由上海生物工程有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 miR-7靶序列的设计与合成 选取miRBase 数据库上小鼠成熟miR-7a-5p序列，根据碱基互补原则设计其反义序列，去掉前两个碱基后在第12-14个碱基处突变为不互补碱基，并将第15个碱基处凸出，将6个拷贝互补靶序列串联，每个拷贝之间由“CGCG”连接，该序列两端加入酶切位点Hind Ⅲ与Kpn I，组成miR-7 Sponge片段(见图1)。由赛业生物科技有限公司分别合成正义链和反义链 ......