张青峰，张芳婷，申慧芳，高书颖

    (1.遵义医学院珠海校区 生物化学与分子生物学教研室， 广东 珠海 519041；2.北京大学深圳医院 中心实验室，广东 深圳 518036)

    端粒 (telomere) 位于染色体末端，是由串联重复的短双链DNA序列和结合蛋白形成的复合体，在维持基因组完整性和功能稳定性方面有着重要作用。重复端粒DNA序列由端粒酶维护。人端粒酶由端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)、端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 和端粒酶相关蛋白 (additional protein components) 组成，hTERT的转录调控是限制端粒酶活性的主要因素[1]。研究发现，hTERT在大多数正常人体细胞中呈低表达或不表达，而在胚胎发育期间、在一些干细胞和大多数肿瘤细胞中表现活性[2]。表达外源hTERT，可以使某些类型的细胞永生化，其中包括马科动物原代成纤维细胞[3]、人间充质基质细胞[4]、人口腔黏膜上皮细胞[5]、人肝细胞[6]等。

    本研究拟构建携带hTERT基因的重组慢病毒表达载体，制备重组慢病毒，检测携带hTERT基因的重组慢病毒对HeLa细胞的感染能力，及其介导外源hTERT基因在被感染细胞中的染色体整合和mRNA表达水平，为进一步研究hTERT基因的功能及构建永生化细胞系奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 细胞株与质粒 人宫颈癌HeLa细胞购自中国科学院上海细胞库；大肠杆菌DH5α由本实验室保存；人胚肾293FT细胞、大肠杆菌Stbl3、质粒pENTR 221-hTERT、pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pLenti6.3/V5-DEST等购自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)。重组质粒pLenti6.3/V5-hTERT由本实验室构建，其结构示意图(见图1)。

    图1 重组质粒pLenti6.3/V5-hTERT的结构示意图

    1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒、质粒转染试剂LipofectamineTM2000、LR clonase II enzyme mix和杀稻瘟菌素 (BSD) 等购自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)；Taq DNA聚合酶EmeraldAmp PCR Master Mix、限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ购自Takara公司 (Dalian, China)；慢病毒浓缩试剂盒PEG-it Virus Precipitation Solution购自System biosciences公司 (Mountain View, CA, USA)；Polybrene购自Sigma公司 (St. Louis, MO, USA) ......