自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义

    郭萌萌，廖珍媛，赵娟娟，陶弋婧，胡燕，陈超，秦娜琳，郑静，徐林

    (遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义563099)

    [摘要]目的 构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体，研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法 预测miR-7启动子序列，设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物，PCR扩增后亚克隆入pGL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro)；将所构建载体转染人肺癌95D细胞， Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平；MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力；划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化；FACS检测95D细胞的凋亡情况。结果 酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体，转染95D细胞后可有效表达miR-7；与对照组相比，p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60±0.03 vs 0.19±0.05，P

    图1 pGL3.0-Basic-miR-7-promoter真核表达载体的示意图

    1.2.3细胞培养与转染培养95D细胞，条件：RPMI1640细胞完全培养液(10%胎牛血清、100 mg/mL链霉素、1 000μ/mL青霉素以及2 mmol/L谷氨酰胺)，37 ℃、5%CO2。当单层细胞生长达到80%融合后，用胰蛋白酶(0.02%)消化收集细胞，PBS轻柔冲洗，将1×105/mL的细胞接种至6孔板(每孔2 mL)，培养12 h ，按照LipofectamineTM2 000转染试剂说明书瞬时转染95D细胞。实验分为2组：pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(p-miR-7-pro)和pGL3.0-Basic空载(p-Cont)转染组 ......