尚 卿，刘远梅，高明娟

    (1.河南省新乡市中心医院 普通外科，河南 新乡 453003；2.遵义医学院附属医院 小儿普胸泌外科，贵州 遵义 563099)

    技术与方法

    新生大鼠肠神经嵴干细胞的体外培养和鉴定

    尚卿1，刘远梅2，高明娟2

    (1.河南省新乡市中心医院 普通外科，河南 新乡453003；2.遵义医学院附属医院 小儿普胸泌外科，贵州 遵义563099)

    [摘要]目的 探索体外分离培养新生大鼠肠神经嵴干细胞(ENCSCs)的方法，观察肠神经嵴干细胞神经球(NLBs)的原代及分化情况。方法 取新生SD大鼠，无菌环境下解剖分离从小肠至直肠的肠管，胰酶消化成单细胞悬液后，接种于培养瓶行原代培养，并传代；传到第3代时，加入分化培养基进行分化培养。观察ENCSCs原代培养及分化培养的情况，免疫荧光染色观察NLBs巢蛋白(nestin)的表达以及分化后ENCSCsHuD蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果 ENCSCs原代培养第1天，可见细胞贴壁成长，第2天，贴壁细胞减少，出现大量悬浮的细胞团，第4天，悬浮细胞团增大，形成体积稍小的NLBs，7 d后，大量NLBs漂浮于培养液中。未分化的NLBs行免疫荧光染色可见nestin阳性表达；NLBs分化后贴壁的细胞可见HuD、GFAP阳性表达。结论 新生大鼠肠道可提取出ENCSCs，培育出ENCSCs神经球，并能够分化成神经元和神经胶质细胞。

    [关键词]肠神经嵴干细胞；细胞培养；细胞分化

    肠道的运动由肠神经系统(enteric nervous system，ENS)控制，其所有神经元和神经胶质细胞均起源于神经嵴干细胞(neural crest stem cell，NCSCs),各种原因引起的神经嵴干细胞迁移、增殖和分化异常，均会造成肠神经元解剖和功能异常，可导致先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease，HD)发生。目前国外研究较多的是胚胎肠神经嵴干细胞(enteric neural crest stem cells,ENCSCs)的分离培养、诱导分化和移植，但是胚胎ENCSCs的提取存在伦理学上的争议，以及异体干细胞移植所带来的免疫排斥反应，因此，成体ENCSCs的体外研究将为以后的移植试验带来新的契机。本研究通过细胞培养和免疫荧光染色方法观察新生大鼠肠道ENCSCs的分离培养、诱导分化以及增殖情况，检测NLBs的nestin及分化后贴壁细胞的HuD蛋白、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达 ......