曾 理，唐泽飞，李春鸣

    (遵义医学院附属医院 病理科，贵州 遵义 563099)

    临床医学研究

    重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP载体的构建及鉴定

    曾 理，唐泽飞，李春鸣

    (遵义医学院附属医院 病理科，贵州 遵义 563099)

    目的 构建携带有NM23的重组腺病毒载体并观察其对人胃癌细胞株BGC-823凋亡的影响。方法 以质粒NM23-PIRES2-EGFP为模版，采用PCR扩增NM23基因，克隆至腺病毒载体pCMV-MCS-IRES-EGFP上，形成重组腺病毒载体pCMV-NM23-IRES-EGFP并酶切鉴定及基因测序。将人胃癌细胞株BGC-823分为实验组(NM23-OE组，感染pCMV-NM23-IRES-EGFP)、空白组(Ctrl组)，阴性对照组(NC组，感染pCMV-MCS-IRES-EGFP)；Real Time PCR和Western Blot分别检测3组细胞中NM23mRNA和蛋白表达；流式细胞仪检测3组细胞凋亡率。结果 经酶切鉴定和基因测序证实成功构建重组腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP；经扩增后，重组腺病毒的滴度为4.0×1010ifu/mL ；RT-PCR及Western blot结果显示，阴性对照组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组的NM23的mRNA和蛋白表达显著高于其他两组(P1 材料与方法

    1.1 实验材料与试剂 质粒NM23-PIRES2-EGFP、人低分化胃腺癌细胞株BGC-823为本实验室保存。人胚肾细胞系HEK293购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。腺病毒载体pCMV-MCS-IRES-EGFP和Anti-Hexon一抗、HRP标记二抗购自上海和元生物技术有限公司。内切酶EcoR I-HF和BamH I-HF酶、T4 DNA连接酶购自上海碧云天生物技术公司代理Fermentas MBI(美国)产品；PCR相关试剂购自Takara公司；兔抗人Flag一抗购自Sigma公司；兔抗人NM23A一抗购自Abcam公司；内参Actin抗体及GAPDH抗体均购自Beyotime公司；ECL+plusTMWestern blotting system试剂盒购自Amersham公司；引物合成由上海和元生物技术有限公司完成。

    1.2 主要仪器 JB-CJ-2FD型超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)；GHP-9050型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；TDZ4-WS型低速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；MHG-100B型荧光显微镜(日本Olympus公司)；5417R台式冷冻高速离心机(Eppendorf 公司)；3111型CO2培养箱(Thermo Fisher)；4200型全自动化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)；-80 ℃超低温冰箱(Thermo Fisher) ......