吴 丹，刘 佳，陈 丹

    (四川省广安市人民医院，四川 广安 638500)

    糖尿病性心肌病是糖尿病患者的主要并发症，是患者长期高血糖所导致的特异性心肌病变[1]。其发病机制是复杂和多因素的，包括氧化应激增加、钙处理受损、肾素-血管紧张素系统上调、底物代谢改变、线粒体功能障碍[2-3]。研究表明，咪达唑仑对缺氧/复氧诱导的新生大鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用[4]，可以改善大鼠心肌氧化应激，保护心肌免受缺血再灌注损伤[5]。在大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型中，咪达唑仑联合右美托咪定可以提高蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)的磷酸化水平，起到心肌保护作用[6]。然而，咪达唑仑是否可以减轻糖尿病性心肌病中心肌细胞的凋亡和氧化应激损伤尚不清楚。磷酸肌醇3激酶(Phospoinositide 3-kinase，PI3K)/AKT信号通路在调节细胞增殖和凋亡中起关键作用[7]。PI3K/AKT信号通路的激活已被证实参与了针对高血糖诱导的心脏损伤的保护[8-9]。本实验探讨咪达唑仑对高糖诱导心肌细胞H9C2损伤的影响及PI3K/AKT信号通路在其中的作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料 心肌细胞H9C2(中科院上海细胞库)；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(美国Gibco公司)；咪达唑仑(江苏恩华药业有限公司)；PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002(美国Sigma-Aldrich公司)；细胞计数试剂盒(CCK-8)(日本Dojindo公司)；辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(上海康成生物公司)；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒、增强化学发光液(ECL)(南京凯基公司)；SOD、MAD检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；PVDF膜(美国Bio-Rad公司)；兔抗PI3K单克隆抗体、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)单克隆抗体、兔抗AKT单克隆抗体、兔抗磷酸化AKT(phospho-AKT，p-AKT)单克隆抗体、兔抗Caspase-3单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

    1.2 细胞培养 将心肌细胞H9C2在添加10% FBS的DMEM培养基中，在5% CO2、95%空气和37℃培养，每2天换液1次。

    1.3 实验分组与处理 将细胞分为对照组(给予5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(给予35 mmol/L葡萄糖[10])、高糖+低剂量药物组(给予5 ng/mL咪达唑仑和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+中剂量药物组(给予10 ng/mL咪达唑仑和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+高剂量药物组(给予20 ng/mL咪达唑仑和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+LY294002组(给予35 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L LY294002[11])、高糖+高剂量药物+LY294002组(给予20 ng/mL咪达唑仑、LY294002和35 mmol/L葡萄糖) ......