李瑞娟，权会琴，王晓艳，边培育，叶传涛，范 超，张 颖，周 云

    (空军军医大学唐都医院传染科，陕西 西安 710038)

    丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)会引起慢性丙型肝炎，进而发展成肝硬化，甚至演变成肝细胞癌。HCV感染后，早期活跃并持续的CD4+T细胞增殖反应能对抗很多HCV蛋白，预测疾病转归[1]。研究发现很多miRNA能调节HCV的复制与疾病发展和预后。miRNA可直接作用于HCV RNA，或通过HCV相关的宿主信号通路来调节HCV复制及疾病进展[2]。本研究小组此前发现HCV能下调miR-181a表达，引起双重特异性磷酸酶6过表达，损害CD4+T细胞功能，导致细胞衰老[3]，还发现HCV感染相关的CD4+T细胞衰老可由ΔNp63-miR-181a-SIRT1信号通路对抗调节[4]。沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1， SIRT1)在HCV感染者CD4+T淋巴细胞上表达增高，但是miR-181a、SIRT1在HCV感染者服用直接抗病毒药物(direct antiviral agents，DAA)治愈后CD4+T淋巴细胞上的表达情况尚无研究。本研究拟检测并比较HCV感染者经DAA治疗前后miR-181a对CD4+T淋巴细胞衰老、负性调节因子相关指标的影响，并探讨其临床意义。

    1 对象与方法

    1.1 对象

    收集在空军军医大学唐都医院传染科就诊的HCV感染者及治愈者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，诊断标准依据世界卫生组织发布的《2016年欧洲肝病学会丙型肝炎治疗指南》[5]。实验分为HCV感染未治疗组(HCV组，26例)、HCV治愈组(22例)、健康对照组(20例)，入组标准及治疗方案同本实验室之前设计方案[6]。具体HCV组入组标准为HCV RNA和抗-HCV阳性6个月以上，年龄大于18岁，排除其他噬肝病毒患者、肝癌患者及自身免疫性肝病患者；HCV治愈组入组标准为慢性丙型肝炎患者完成12周抗病毒治疗，达到病毒学应答，HCV RNA均低于检测下限，肝功能指标ALT、AST正常，治疗采用索磷布韦联合达卡他韦方案。本研究经空军军医大学唐都医院医学伦理委员会批准(许可证号：TDLL-2016142)，并与患者及健康对照者签署知情同意书。

    主要试剂：用于磁珠分选细胞的CD4+T淋巴细胞分离试剂盒购自德国美天旎公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自德国Qiagen公司；miR-181a引物、P53、P21引物购自上海生工公司；hsa-miR-181a-5p和SIRT1基因双荧光素酶检测由上海生工公司提供；流式抗体CD3、CD4、CD57、SIRT1等购自美国BD公司；RPMI1640、OPT-MEM Ⅰ 培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司 ......