注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品鉴别试验方法的建立(2)
检测结果显示rhCNB对照品与供试品均能有效检出条带，结果为阳性，白蛋白不显色，结果为阴性，满足专属性试验要求。
【耐用性试验】
设置一抗浓度0.45?g/ml(正常浓度的90%)、0.55?g/ml两个浓度。免疫检测：①把已转好的膜放入封闭液中封闭60分钟。②弃去封闭液，分别加入一抗溶液(取rhCNB抗体2支，各加水200?l复溶，混匀，分别量取4.45?l、5.44?l，各置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液5ml，混匀制得一抗浓度分别为0.45?g/ml、0.55?g/ml。)室温过夜。③弃去一抗，用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液洗膜3次，每次8分钟；再加入用TTBS缓冲液稀释好的二抗(取分装好的二抗(羊抗小鼠)2支，各取5μl，置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液4ml，混匀即得)，室温放置40分钟。④用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟；⑤取DAB试剂盒中HRP反应缓冲液2ml，试剂A、试剂B、试剂C各100?l，混匀于烧杯，放入NC膜，避光显色15分钟。
结果表明，抗体配制浓度偏差±10%，对检测结果无明显影响，耐用性良好。
【方法学验证结果】rhCNB免疫印迹法鉴别试验有良好专属性和耐用性，适用成品鉴别项检查。
3、注射用rhCNB成品鉴别试验检测结果
按本法检测连续6批注射用rhCNB鉴别试验。结果均呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》(草案)的规定。
四、讨论
根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》【6】的要求，并参照国内已上市重组蛋白类药物，如注射用重组人干扰素α2a、重组人白介素-2注射液、注射用重组人粒细胞刺激因子等，均建有鉴别试验检查项，方法为免疫印迹法或免疫斑点法。
按《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》进行该方法的专属性、耐用性验证，验证结果良好。6批注射用rhCNB样品检测结果呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》(草案)的规定。
五、结论
该专属性、耐用性良好，适用于注射用rhCNB成品制剂鉴别试验检测。
参考文献
[1] 國家药品审评中心[S]GPH1-1《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》
[2] 含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物 中国专利
[3] 中国药典.三部[S].2010.
[4] 《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》 药审中心 2003年, http://www.100md.com(程白冰)
【耐用性试验】
设置一抗浓度0.45?g/ml(正常浓度的90%)、0.55?g/ml两个浓度。免疫检测：①把已转好的膜放入封闭液中封闭60分钟。②弃去封闭液，分别加入一抗溶液(取rhCNB抗体2支，各加水200?l复溶，混匀，分别量取4.45?l、5.44?l，各置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液5ml，混匀制得一抗浓度分别为0.45?g/ml、0.55?g/ml。)室温过夜。③弃去一抗，用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液洗膜3次，每次8分钟；再加入用TTBS缓冲液稀释好的二抗(取分装好的二抗(羊抗小鼠)2支，各取5μl，置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液4ml，混匀即得)，室温放置40分钟。④用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟；⑤取DAB试剂盒中HRP反应缓冲液2ml，试剂A、试剂B、试剂C各100?l，混匀于烧杯，放入NC膜，避光显色15分钟。
结果表明，抗体配制浓度偏差±10%，对检测结果无明显影响，耐用性良好。
【方法学验证结果】rhCNB免疫印迹法鉴别试验有良好专属性和耐用性，适用成品鉴别项检查。
3、注射用rhCNB成品鉴别试验检测结果
按本法检测连续6批注射用rhCNB鉴别试验。结果均呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》(草案)的规定。
四、讨论
根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》【6】的要求，并参照国内已上市重组蛋白类药物，如注射用重组人干扰素α2a、重组人白介素-2注射液、注射用重组人粒细胞刺激因子等，均建有鉴别试验检查项，方法为免疫印迹法或免疫斑点法。
按《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》进行该方法的专属性、耐用性验证，验证结果良好。6批注射用rhCNB样品检测结果呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》(草案)的规定。
五、结论
该专属性、耐用性良好，适用于注射用rhCNB成品制剂鉴别试验检测。
参考文献
[1] 國家药品审评中心[S]GPH1-1《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》
[2] 含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物 中国专利
[3] 中国药典.三部[S].2010.
[4] 《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》 药审中心 2003年, http://www.100md.com(程白冰)