动态比浊法测定并控制小容量注射剂中间产品细菌内毒素(1)
摘要：1968年建立的鲎试剂内毒素检查法是控制药品热原反应的重要方法。近年来对内毒素结构功能与作用机制的不断深入研究，使需要通过鲎试剂进行内毒素检查的品种呈倍数增加，检测方法也从定性法发展到定量法，如何实现生产过程中对药品内毒素水平的定量检测成为一项重大课题。本文主要阐述了小容量注射剂生产各环节中如何排查和控制细菌内毒素，并记录了动态比浊法定量检测细菌内毒素的实验结果，更直观的监控生产过程中内毒素含量的变化趋势。
关键词：细菌内毒素 鲎试验法 动态比浊法
【中图分类号】186.3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306(2019)02-152-03
1.细菌内毒素与热原反应
细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖成分，在细菌死亡或自溶后被释放，作为外源性致热源作用于中性粒细胞，使之释放内源性致热源而引起发热，即热原反应。WHO文件中提到，在药检范围内控制内毒素就是控制热原。内毒素通过消化道时或少量注射入血时不造成机体损害，若大量入血，可对机体产生不同程度的致病作用。因此，注射用药剂、化学药品类及医疗器材类等必须经过试验合格后才能使用。
2015年版中国药典收录两种细菌内毒素检查法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和顯色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
2.细菌内毒素与生产控制
生产小容量注射剂过程中应从体系上总体控制内毒素水平，对物料、人员、生产环境、药品生产过程等进行监控，了解其初始内毒素负荷，并根据产品设定标准的内毒素限值，分析生产过程中内毒素负荷，合理设置内毒素监测点，制定各监测点内毒素控制水平，确保产品符合最初设计要求。
2.1物料控制
2.1.1注射用水
注射用水排查中应至少对配制用水使用点和分配系统中总送、回水口注射用水使用点进行内毒素检查，确定注射用水原始内毒素负荷。《中国药典》2015年版中规定注射用水细菌内毒素限量为每1ml应小于0.25EU，浊度法能确定注射用水原始内毒素定量值，这对有些内毒素标准要求极为严苛的产品来说尤其重要。
2.1.2一般原辅料
要根据小容量注射剂产品的限量要求和原辅料的加入量设置原辅料的内毒素限量标准。目前很多原辅料并没有设置内毒素检查标准，因此，同一种原料生产不同制剂时，内毒素标准是不一样的，非药典方法设定的内毒素检查方法应进行内毒素检查方法学验证。
2.1.3活性炭
国外目前流行无炭化生产，国内一般还采取传统的加炭吸附除热原以控制内毒素。《中国药典》2015年版规定，检查活性炭中所含内毒素本底值及活性炭对细菌内毒素吸附力，以确保其原始内毒素负荷和吸附效率，避免因活性炭引入内毒素而带来不良影响。
2.1.4气体
对小容量注射剂产品使用的压缩空气、氮气等直接接触药品的气体应进行终端除菌过滤，在无菌验证合格的基础上进行细菌内毒素取样检测，对样品进行细菌内毒素浊度法检查。
2.1.5包装容器
小容量注射剂一般采用安瓿或西林瓶包装，最终的清洗灭菌采用隧道灭菌烘箱，烘箱对细菌内毒素的103挑战试验应在确认周期内，运行中可以记录和观察灭菌温度、运行速度，以确保工艺去除内毒素的能力。
2.2人员控制
为了维持产品的无菌性，涉及无菌作业的操作人员在允许进入无菌生产区和进行操作前都应遵循无菌技术原则，并进行适当培训，包括无菌服着装控制、无菌技术、洁净室行为准则、微生物学、卫生、着装、无菌操作等；并制定经常性培训计划定期培训和考核新内容。
产品灌封结束后，应对操作人员5指手套进行表面微生物取样检测，以确认是否产生污染。
2.3生产环境监测
根据GMP2010年的修订要求，洁净区的设计必须符合相应的洁净度要求，达到“静态”和“动态”的标准，评估无菌生产的微生物状况；无论生产洁净室何种方式消毒，均需对消毒效果确认。
2.4生产过程控制
2.4.1配制
除按工艺要求配制外，还需注意配制灌封系统管道排查是否存在设计死角，其清洁及消毒的全过程，药液及气体除菌过滤器使用前后的完整性检查。
对配制药液取样：对稀配完成的产品进行原始内毒素负荷取样；对始终灌封药液取样。
2.4.2灌封
按照无菌操作的要求进行灌装装配和药液灌装。
对灌封产品取样：每台灌封始排药液的取样；每台设备灌封前中后产品取样并标记。
2.4.3灭菌与检漏
按灭菌工艺灭菌温度、时间、装载方式、装载量等的要求进行灭菌与检漏。取样将灭菌前后产品进行细菌内毒素负荷对比。
细菌内毒素与比浊法
因一般传统凝胶法只进行内毒素限量检查，无法定量，因此在生产过程中为了解其负荷情况，采用浊度法对内毒素进行定量检查，便于快速准确地控制内毒素污染状况，提高产品质量的可控性。
3.1仪器与试药
LKM-02-32 型动态试管检测仪，小容量注射剂生产过程中样品(郑州卓峰制药有限公司自产)、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂。
3.2方法与结果
3.2.1细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性分析
用BET检查用水将细菌内毒素工作标准品稀释制成终浓度分别为2、0.25、0.03EU/ml的内毒素溶液，各取0.1ml，分别加到预先加入0.1ml鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入细菌内毒素检测仪内进行检测，每一浓度作3管，同时作阴性对照。以平均反应时间的对数LgT为纵坐标，细菌内毒素的浓度对数LgC为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为：LgT=-0.28711LgC+2.8020，r=-0.9984(绝对值应大于0.980)，平行管之间的RSD均小于10%，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间，细菌内毒素标准曲线结果成立。, http://www.100md.com(王静)
关键词：细菌内毒素 鲎试验法 动态比浊法
【中图分类号】186.3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306(2019)02-152-03
1.细菌内毒素与热原反应
细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖成分，在细菌死亡或自溶后被释放，作为外源性致热源作用于中性粒细胞，使之释放内源性致热源而引起发热，即热原反应。WHO文件中提到，在药检范围内控制内毒素就是控制热原。内毒素通过消化道时或少量注射入血时不造成机体损害，若大量入血，可对机体产生不同程度的致病作用。因此，注射用药剂、化学药品类及医疗器材类等必须经过试验合格后才能使用。
2015年版中国药典收录两种细菌内毒素检查法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和顯色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
2.细菌内毒素与生产控制
生产小容量注射剂过程中应从体系上总体控制内毒素水平，对物料、人员、生产环境、药品生产过程等进行监控，了解其初始内毒素负荷，并根据产品设定标准的内毒素限值，分析生产过程中内毒素负荷，合理设置内毒素监测点，制定各监测点内毒素控制水平，确保产品符合最初设计要求。
2.1物料控制
2.1.1注射用水
注射用水排查中应至少对配制用水使用点和分配系统中总送、回水口注射用水使用点进行内毒素检查，确定注射用水原始内毒素负荷。《中国药典》2015年版中规定注射用水细菌内毒素限量为每1ml应小于0.25EU，浊度法能确定注射用水原始内毒素定量值，这对有些内毒素标准要求极为严苛的产品来说尤其重要。
2.1.2一般原辅料
要根据小容量注射剂产品的限量要求和原辅料的加入量设置原辅料的内毒素限量标准。目前很多原辅料并没有设置内毒素检查标准，因此，同一种原料生产不同制剂时，内毒素标准是不一样的，非药典方法设定的内毒素检查方法应进行内毒素检查方法学验证。
2.1.3活性炭
国外目前流行无炭化生产，国内一般还采取传统的加炭吸附除热原以控制内毒素。《中国药典》2015年版规定，检查活性炭中所含内毒素本底值及活性炭对细菌内毒素吸附力，以确保其原始内毒素负荷和吸附效率，避免因活性炭引入内毒素而带来不良影响。
2.1.4气体
对小容量注射剂产品使用的压缩空气、氮气等直接接触药品的气体应进行终端除菌过滤，在无菌验证合格的基础上进行细菌内毒素取样检测，对样品进行细菌内毒素浊度法检查。
2.1.5包装容器
小容量注射剂一般采用安瓿或西林瓶包装，最终的清洗灭菌采用隧道灭菌烘箱，烘箱对细菌内毒素的103挑战试验应在确认周期内，运行中可以记录和观察灭菌温度、运行速度，以确保工艺去除内毒素的能力。
2.2人员控制
为了维持产品的无菌性，涉及无菌作业的操作人员在允许进入无菌生产区和进行操作前都应遵循无菌技术原则，并进行适当培训，包括无菌服着装控制、无菌技术、洁净室行为准则、微生物学、卫生、着装、无菌操作等；并制定经常性培训计划定期培训和考核新内容。
产品灌封结束后，应对操作人员5指手套进行表面微生物取样检测，以确认是否产生污染。
2.3生产环境监测
根据GMP2010年的修订要求，洁净区的设计必须符合相应的洁净度要求，达到“静态”和“动态”的标准，评估无菌生产的微生物状况；无论生产洁净室何种方式消毒，均需对消毒效果确认。
2.4生产过程控制
2.4.1配制
除按工艺要求配制外，还需注意配制灌封系统管道排查是否存在设计死角，其清洁及消毒的全过程，药液及气体除菌过滤器使用前后的完整性检查。
对配制药液取样：对稀配完成的产品进行原始内毒素负荷取样；对始终灌封药液取样。
2.4.2灌封
按照无菌操作的要求进行灌装装配和药液灌装。
对灌封产品取样：每台灌封始排药液的取样；每台设备灌封前中后产品取样并标记。
2.4.3灭菌与检漏
按灭菌工艺灭菌温度、时间、装载方式、装载量等的要求进行灭菌与检漏。取样将灭菌前后产品进行细菌内毒素负荷对比。
细菌内毒素与比浊法
因一般传统凝胶法只进行内毒素限量检查，无法定量，因此在生产过程中为了解其负荷情况，采用浊度法对内毒素进行定量检查，便于快速准确地控制内毒素污染状况，提高产品质量的可控性。
3.1仪器与试药
LKM-02-32 型动态试管检测仪，小容量注射剂生产过程中样品(郑州卓峰制药有限公司自产)、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂。
3.2方法与结果
3.2.1细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性分析
用BET检查用水将细菌内毒素工作标准品稀释制成终浓度分别为2、0.25、0.03EU/ml的内毒素溶液，各取0.1ml，分别加到预先加入0.1ml鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入细菌内毒素检测仪内进行检测，每一浓度作3管，同时作阴性对照。以平均反应时间的对数LgT为纵坐标，细菌内毒素的浓度对数LgC为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为：LgT=-0.28711LgC+2.8020，r=-0.9984(绝对值应大于0.980)，平行管之间的RSD均小于10%，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间，细菌内毒素标准曲线结果成立。, http://www.100md.com(王静)