ＳＤ大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎模型的建立(3)
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3 讨论
3 1 实验动物品系的探讨 不同种类的动物对EAE的易患性是不同的，现公认对EAE敏感的品系有Lewis大鼠，DA大鼠等，但是，国内缺乏这些敏感品系，且价格昂贵，这就给国内研究者带来极大的不便。此外，Lewis大鼠，DA大鼠虽属于自身免疫疾病易感动物，但是许多文献表明使用不同的方法诱导此两种敏感大鼠，其临床症状可存在明显的差别。如MBP73～86和MBP87～99对于Lewis大鼠是致脑炎因子，然而用在DA大鼠则不发病。另一方面，Lewis大鼠需要使用诱导DA大鼠2倍剂量的MOG才能发病，且发病率低，发病时间晚[2-3]。所以，有些学者认为，诱导EAE模型需要考虑大鼠对应的敏感的免疫原，而不是单单考虑品系问题。基于以上的原因，国内已有学者尝试使用非敏感系的Wistar大鼠诱导EAE，但报道的EAE发病率差异较大，如马太花等报道的Wistar大鼠EAE模型的发病率达91 3%[4],而彭津平等的报道则仅有30%[5]。此外，国外有文献报道Wistar大鼠经常会对由动物MBP诱导的EAE有耐受现象，表现为不发生EAE或产生的症状不明显，且易于缓解[6]。本实验使用国内常见的另一非敏感系SD大鼠，尝试使用不同的免疫原，不同的注射方法成功的诱导出缓解-复发型的EAE模型，其中，E组(2SD-SCH,♂)采用同种脑脊髓匀浆，两次注射雌性SD大鼠，其发病率为85%，复发率为46 67%，而致死率仅有5 88%，具有更广的应用前景。
3 2 免疫原的选择 目前诱发EAE模型的免疫原可分为两大类：第一类为人工合成的各种髓鞘蛋白，如MBP，PLP，rMOG等；第二类为自提取的同种或异种脑脊髓匀浆。人工合成的髓鞘蛋白价格昂贵，试验成本高，而自提取的脑脊髓匀浆取材容易，制作简单，价格便宜。本研究使用自提取的同种和异种脑脊髓匀浆诱发EAE模型，并取得成功。本实验所采用的两种免疫原分别为同种的SD大鼠脊髓脑匀浆(SD spinal cord homogenate, SD-SCH)和异种的牛脊髓脑匀浆(bovine spinal cord homogenate，BSCH)。本实验研究发现使用异种脑脊髓匀浆诱导的EAE动物模型表现为一种超急性的炎症反应，临床症状急，重，致死率高，且不易诱发缓解-复发型EAE。B组(BSCH,♂)，C组(2BSCH,♂)两组动物分别在2天，2～4天内达到高峰。其中B组的死亡率高达70%，是各组死亡率中最高的，而无复发现象。另一方面，同种脑脊髓匀浆诱导的EAE动物模型临床症状持续时间长，发病率、复发率高，而致死率低，较异种脑脊髓匀浆诱导的模型可靠，稳定。如E组(2SD-SCH,♂)两次的发病持续时间分别为16～20天，10～14天；发病率为85%，复发率为46 67%，而致死率仅有5 88%。从病理改变来看，异种脑脊髓匀浆诱导的动物模型主要以血管周围炎症及炎性细胞浸润为主，鲜少见到脱髓鞘现象，而同种脑脊髓脑匀浆诱导的动物模型则正好相反。可见，从临床症状及病理改变来看，同种脑脊髓脑匀浆诱导的动物模型更接近人类MS的发病特点。
3 3 注射方法的对比 诱发EAE动物模型有一次注射和多次注射两种注射方法，不同的注射方法，不但可以影响EAE的发生率，还可影响其发展和转归，有报道认为诱发多次注射易引发免疫耐受。本研究采用大剂量(0 1ml/100g)一次注射和中等剂量(0 06ml/100g)多次注射两种方法，发现多次注射诱导的大鼠并无免疫耐受的情况，而且其表现为急性起病后缓解-复发病程特点，这也是一次注射诱导的大鼠所没有的。如本实验中用多次注射法诱导的C组(2BSCH,♂)的复发率(33 33%)和E组(2SD-SCH,♂)的复发率(46 67%)，就分别比一次注射法诱导B组(BSCH,♂)的复发率(0%)和D组(1SD-SCH,♂)的复发率(25%)高。其具体的机制，尚不清楚。然而，目前普遍认为MS及EAE活动期存在血-脑屏障的损害[7]。一旦血-脑屏障遭到破坏则不能维持CNS的自稳状态，也为CNS和外周免疫系统之间的接触提供了可能，这可能是多次注射组的复发率高于一次注射组的原因。
3 4 动物性别对模型建立的影响 国内外研究表明，许多动物都可用于建立EAE模型，但发病都存在性别差异[8-9]。Palaszynski KM等采用脑脊髓匀浆免疫SJL雌雄小鼠，结果雌性发病，雄性不发病，而用PLP139-151免疫则雄性表现为单时相病程而雌性呈现为缓解-复发的特点[9]。本研究发现E组(♂)动物的发病率、症状持续时间、复发率都较F组(♀)高，而死亡率又较F组(♀)低，表现为明显的缓解-复发的临床过程，与相关报道相符。目前对于EAE/MS性别差异的机制仍不清楚，普遍认为EAE/MS是一种CD4+(Th)细胞介导的炎性脱髓鞘疾病，维持Th1和Th2反应以及与之有关细胞因子的适当平衡是EAE/MS发生和转归的关键。由此推测，EAE的性别差异可能与淋巴细胞亚型及其分泌的细胞因子有关。Palaszynski KM等的研究也发现雄鼠T细胞产生Th2类型细胞因子，而雌鼠产生Th1类型细胞因子[9]。
3 5 病理改变的探讨 传统认为MS是以白质病变为特征的脱髓鞘性疾病，不存在皮质的改变。而近年来的研究发现MS患者发病时除了存在白质病灶之外，可同时出现皮层的病理改变[10]。与报道相符，作者在本实验建立的EAE模型中发现大鼠皮层也出现炎性细胞侵润等特征性的病理改变，这表明MS确实是以脑和脊髓白质病变为主累及皮质的脱髓鞘性疾病。此外，前面我们提到本实验中采用异种脑脊髓匀浆诱导的动物模型如B、C组动物的病理改变主要以血管周围炎症及炎性细胞浸润为主，现少见到脱髓鞘现象；而同种脑脊髓脑匀浆诱导的动物模型如D、E、F组则正好相反，特别是E组第二次发病后的动物炎症反应不明显，可见与人类MS相似的脱髓鞘病灶，血管周围胶质细胞增生,甚至能看到噬神经现象[11]。由于此研究只是对EAE病理改变的初步观察，对于不同组所见到的模型之间病理变化的差别目前只能推测与免疫原的不同，病变过程等因素有关，详细的病理机制未见相关报道，尚待进一步探讨。
在EAE动物模型的建立过程中，EAE大鼠的临床经过与动物品系、性别，免疫原的选择，注射方法等诸多因素有关，重要的是通过实验，对各方面因素进行合适的调整，建立一个理想的、稳定的、动物模型以利于后期研究。我们通过多次的探讨，摸索和改进，发现使用同种脑脊髓匀浆，多次注射雌性SD大鼠，辅以同时皮内注射0 2ml百日咳杆菌(2 x 1010个菌体/ml)，可以诱发稳定，可靠的EAE模型，其具有缓解-复发病程，与MS相似的的病理改变，能很好模拟人类MS的发病过程。该方法具有简单、经济、可靠，稳定；高发病率、高复发率、而死亡率低等特点，是一种很好的EAE模型诱导方法，适于在国内开展。
参考文献
[1] Ahn M, Kang J, Lee Y, et alPertusis toxin-induced hyperacute autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats is correlated with increased expression of inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor alpha[J]Neurosci Lett, 2001, 308(1):41-44
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