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实用免疫细胞与核酸分子杂交技术

前言

第一章 总论

  第一节 有关的免疫学理论

    一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系

      (一)抗原
(二)抗体
(三)抗原与抗体的关系

    二、抗原的性质及种类

      (一)抗原的性质
(二)抗原的种类

    三、抗体的性质和种类

      (一)抗体的一般性质
(二)抗原性和分类特征
(三)抗体的种类
(四)抗原与抗体的反应

    四、抗体形成的机理

      (一)免疫反应的形成
(二)影响抗体产生的因素

    五、补体的系统

  第二节 免疫细胞化学的有关技术概述

    一、抗体的制备和配制

      (一)抗体的制备
(二)抗体的配制

    二、组织材料的处理
三、免疫染色
四、对照

      (一)阳性对照
(二)阴性对照

    五、免疫细胞化学结果的判断

      (一)阳性细胞的染色特征
(二)染色失败的几种原因

  第三节 有关细胞和组织学技术

    一、细胞和组织

      (一)细胞标本的取材
(二)组织标本的取材

    二、细胞和组织的固定

      (一)固定
(二)固定剂
(三)固定方法

    三、组织切片技术

第二章 抗原与抗体的制备

  第一节 抗原的制备

    一、抗原的提取

      (一)材料的选择及预处理
(二)细胞的粉碎
(三)抗原的提取
(四)抗原的分离与纯化
(五)抗原的浓缩

    二、免疫原的制备

      (一)载体
(二)偶联剂
(三)制备过程

  第二节 抗体的制备

    一、抗血清的制备

      (一)用于免疫的动物
(二)免疫途径
(三)佐剂
(四)免疫方法
(五)抗血清的采集与保存
(六)抗血清质量的评价
(七)免疫失败的可能原因及应采取的措施

    二、单克隆抗体的制备

      (一)动物的选择与免疫
(二)细胞融合
(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测
(四)杂交瘤的克隆化 
(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏
(六)单克隆抗体的大量生产
(七)单克隆抗体的鉴定

  第三节 抗体的提取与纯化

    一、盐析法
二、冷酒精沉淀法
三、DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白

      (一)操作步骤
(二)注意事项

    四、SPA-sepharose CL-4B亲合层析纯化lgG及lgG亚类

      (一)原理
(二)操作步骤
(三)试剂器材
(四)注意事项

    五、高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

      (一)原理
(二)操作步骤
(三)试剂和器材
(四)注意事项  

第三章 免疫荧光细胞化学技术

  第一节 免疫荧光细胞化学的原理

    一、直接法
二、间接法
三、补体法
四、双重免疫荧光标记法
五、对照试验

  第二节 荧光抗体的制备

    一、荧光素

      (一)异硫氰酸荧光素(FITC)
(二)四乙基罗达明(RB200)
(三)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)

    二、荧光素标记抗体的方法

      (一)FITC标记抗体的方法
(二)四乙罗达明标记抗体方法
(三)四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
(四)藻红蛋白标记抗体方法
(五)PE-标记蛋白A方法
(六)蓝色荧光素标记抗体方法

    三、荧光抗体的质量控制

      (一)染色特异性和敏感性的测定
(二)F/P比值的测定

    四、荧光抗体的保存

  第三节 免疫荧光细胞化学染色方法

    一、标本制作
二、荧光抗体染色方法

      (一)直接法
(二)间接法
(三)补体法
(四)膜抗原荧光抗体染色
(五)双重染色法
(六)荧光抗体再染色法

    三、荧光抗原染色法

  第四节 荧光显微镜检查法

    一、荧光显微镜

      (一)光源
(二)滤色系统
(三)反光镜
(四)聚光镜
(五)物镜
(六)目镜
(七)落射光装置

    二、荧光显微镜标本制作要求

      (一)载玻片
(二)盖玻片
(三)标本
(四)封裱剂
(五)镜油

    三、使用荧光显微镜的注意事项
四、荧光图像的记录方法

  第五节 非特异性染色的消除方法

    一、非特异性染色的主要因素
二、消除非特异性染色的方法

      (一)动物脏器粉未吸收法
(二)透析法
(三)葡聚糖凝胶G-50柱层析法
(四)DEAF纤维素柱层析法
(五)荧光抗体稀释法
(六)纯化抗原法
(七)纯化抗体法--免疫吸收法
(八)伊文氏蓝(Evans blue)衬染法

第四章 免疫酶细胞化学

  第一节 固定和切片

    一、固定
二、切片

  第二节 染色方法

    一、酶标抗体法

      (一)酶的种类及特点
(二)酶标抗体的制备
(三)酶标抗体的纯化
(四)染色原理及步骤

    二、非标记抗体酶法

      (一)酶桥法
(二)PAP法

  第三节 结果分析

    一、对照实验
二、假阳性及其处理
三、抗体有关事项
四、单克隆抗体
五、增加染色强度方法

  第四节 ICC的几种特殊应用

    一、ICC在铺片中应用
二、ICC的双重染色法

      (一)切片
(二)染色

    三、ICC在细胞功能研究中的作用
四、ICC在原位杂交技术中的应用

第五章 免疫金银及铁标记技术

  第一节 免疫金技术发展史

  第二节 溶胶的基本概念

    一、胶体金

      (一)离子分散体系
(二)胶体分散体系
(三)粗分散体系

    二、胶体金的一般性状

      (一)胶体金的颜色
(二)胶体金的稳定性
(三)溶胶的聚沉现象

  第三节 胶体金的制备方法

    一、制备胶体金的准备

      (一)玻璃器皿的清洁
(二)试剂的配制要求

    二、制备胶体金的方法和步骤

      (一)白磷还原法
(二)抗环血酸还原法
(三)柠檬酸三钠还原法
(四)鞣酸一柠檬酸三钠还原法
(五)乙醇超声波还原法
(六)硼氢化钠还原法
(七)放射性胶体金的制备方法
(八)微波制备液体金的方法

  第四节 胶体金的质量鉴定

    一、胶体金颗粒直径测定
二、胶体金金颗粒均匀度测定
三、影响胶体金颗粒大小的因素

  第五节 胶体金标记物的制备

    一、待标记蛋白质的准备
二、胶体金pH值的调整
三、待标记蛋白质最适稳定量的测定
四、蛋白质的胶体金标记
五、胶体金标记蛋白质的纯化

      (一)高速与超速离心法
(二)凝胶过滤法

  第六节 免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择

    一、固定剂的选择及固定时间
二、切片的处理与粘附

  第七节 光镜免疫金银细胞化学方法

    一、免疫金染色

      (一)免疫金染色(IGS)
(二)蛋白A-金(PAG)放大法

    二、免疫金银法

      (一)石蜡切片的IGSS染色
(二)冰冻切片的IGSS染色
(三)半薄切片的IGSS染色

    三、彩色免疫金银法(CIGSS)
四、免疫金及免疫金银技术的优点
五、在IGSS染色中常见技术问题和对策

      (一)背景染色产生的原因
(二)背景染色已发生应如何消除
(三)彩色显影背景过染的处理方法

    六、物理显影液及缓冲液的配制

      (一)缓冲液的配制
(二)银显影液的配制
(三)柠檬酸缓冲液的配制
(四)氢氧化钠(NaOH)无水乙醇饱和溶液的配制

  第八节 免疫胶体铁细胞化学

    一、胶体铁的制备方法
二、抗体的标记和纯化
三、胶体铁标记抗体的鉴定
四、免疫胶体铁细胞化学染色
五、方法的应用

第六章 亲合组织化学技术及免疫细胞化学技术的某些进展

  第一节 抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法

    一、基本原理
二、几种抗生物素-生物素染色法

  第二节 葡萄球菌蛋白A(SPA)

    一、SPA的性质
二、SPA的应用
三、SPA的在免疫细胞化学染色中的应用

  第三节 凝集素

    一、凝集素的特性
二、凝集素的应用
三、凝集素在免疫细胞化学中的应用
四、HRP标记凝集素及抗凝集素抗体的制备

  第四节 免疫细胞化学技术的某些新进展

第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术

  第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述

    一、细胞固定与取材
二、免疫染色
    三、包埋

      (一)树脂包埋
(二)低温包埋

    四、对照试验

  第二节 免疫铁蛋白技术

    一、基本原理
    二、铁蛋白的提取和纯化
    三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合
    四、电镜标本的制备方法

  第三节 免疫酶细胞化学技术

    一、基本原理
二、电镜标本制备方法

  第四节 免疫电镜胶体金标记法

    一、电镜水平的免疫金染色法
    二、胶体金标记蛋白A技术
    三、胶体金或多双标记技术
    四、免疫电镜金-银法染色技术

  第五节 其它免疫电镜技术

    一、凝集素电镜标记技术
二、扫描免疫电镜技术

      (一)标记物
(二)免疫标记方法
(三)扫描免疫电镜的具体操作步骤

    三、冷冻蚀刻免疫电镜技术

第八章 蛋白质与多肽激素的放射免疫分析

  第一节 概述

    一、放射免疫分析的优缺点

      (一)RIA的优点
(二)RIA的缺点

    二、基本原理

  第二节 放射性碘标记

    一、同位素的选择
二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记

      (一)氯铵T法
      (二)乳过氧化物酶法
      (三)lodogen碘化法
      (四)酰化试剂(Bolton 和Hunter试剂)法

    三、放射性标记化合物的纯化与鉴定

      (一)纯化标记化合物的常用方法
(二)标记化合物的主要质量指标

  第三节 结合和游离部分的分离

    一、对分离方法的要求

二、常用的分离方法

      (一)吸附分离法
(二)沉淀分离法
(三)双抗体分离法
(四)磁性分离法
(五)固相包被分离法
(六)双抗体+PEG的分离法

  第四节 样品的前处理

    一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取(以大鼠为例)
二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法(以下丘脑为例)
三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取(以胃粘膜为例)
四、血浆
五、脑脊液
六、尿
七、胃液

  第五节 放射免疫分析法的建立

    一、放射免疫分析的基本试剂

      (一)标准品
(二)标记物
(三)抗体
(四)B与F分离剂
(五)缓冲液

    二、加样程序

      (一)平衡饱和加样程序
(二)顺序饱和加样程序
(三)计数、绘制标准曲线与测定样品含量

    三、放射免疫分析的质量控制

      (一)质量控制的目的和内容
(二)放射免疫分析中造成测量误差的因素
(三)放射免疫分析中测量误差的控制

第九章 免疫细胞化学与图像分析

  一、定量分析的重要性
二、图像分析仪简介
三、常用的测量方法

    (一)灰度
    (二)长度
    (三)面积

  四、图像分析仪工作程序
五、没有图像分析仪可否进行图像分析
六、实例介绍
七、图像分析与体视学
八、国内外生产图像分析仪的情况简介

    (一)国内情况
    (二)国外情况

第十章 流式细胞术(FCM)在免疫细胞化学中的应用

  第一节 流式细胞简介

    一、流式细胞术发展简史
二、流式细胞计的基本结构和工作原理

  第二节 FCM在生物医学工程学方面的应用

    一、FCM应用的技术途径
二、FCM在典型应用简介

  第三节 FCM对外周血白细胞的免疫荧光分析

    一、白细胞的免疫荧光标记技术
二、白细胞免疫荧光分析的数据分析
三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义

第十一章 免疫细胞化学在神经科学中的应用

  一、确定神经递质的性质、定性和分布
二、探查和发现新的神经递质
三、追踪神经束的行径及其投射区
四、区别神经细胞、神经胶质细胞和神经内分泌细胞
五、研究神经递质的超微结构定位
六、神经递质共存的研究
七、个体和种族发育的研究
八、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究
九、应用于受体的研究
十、神经系统的机能研究

第十二章 肿瘤免疫细胞化学

  第一节 神经肿瘤免疫细胞化学

    一、细胞骨架中的中间丝蛋白

      (一)神经细丝酸性蛋白
(二)神经细丝

    二、神经特异性烯醇化酶
三、S-100蛋白

  第二节 神经内分泌肿瘤免疫细胞化学

    一、垂体腺瘤

      (一)生长激素腺瘤
(二)催乳激素腺瘤
(三)促甲状腺激素腺瘤
(四)促肾上腺皮质激素腺瘤
(五)促性腺激素腺瘤
(六)多种激素性腺瘤
(七)无功能活性腺瘤

    二、胰岛细胞瘤
三、甲状腺髓样癌
四、肺支气管类癌及肺小细胞癌
五、食管燕麦细胞癌
六、皮肤神经内分泌癌(Merker细胞瘤)

  第三节 软组织与骨肿瘤细胞化学

    一、常用标记抗体
二、软组织肿瘤免疫组织化学

      (一)纤维组织与纤维组织细胞性肿瘤免疫细胞化学标记
(二)肌源性肿瘤的免疫细胞化学标记
(三)血管源肿瘤免疫细胞化学标记
(四)双向分化的软组织肿瘤免疫细胞化学标记
(五)脂肪源肿瘤免疫细胞化学标记
(六)外周神经肿瘤免疫细胞化学标记
(七)组织发生未定的软组织肿瘤

    三、骨及软骨肿瘤免疫细胞化学标记

  第四节 免疫活性细胞及其肿瘤的免疫细胞化学

    一、免疫活性细胞的免疫细胞化学

      (一)B淋巴细胞
(二)T淋巴细胞
(三)NK细胞/K细胞
(四)单核/巨噬细胞与网状细胞

    二、恶性淋巴瘤的免疫细胞化学标记

      (一)恶性淋巴瘤与淋巴网状组织反应性增生的鉴别诊断
(二)恶性淋巴瘤与非淋巴网状组织肿瘤的鉴别
(三)恶性淋巴瘤的免疫功能分析
(四)在恶性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事项

  第五节 上皮组织肿瘤免疫细胞化学

    一、角蛋白

      (一)角蛋白抗体及其在肿瘤病理学中的应用
(二)有关方法学应注意的问题

    二、器官特异性及其它肿瘤标记物

      (一)上皮膜抗原
(二)桥粒蛋白
(三)癌胚抗原
(四)甲胎蛋白
(五)前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酯酶
(六)CA19-9及CA50
(七)CA125
(八)神经元特异性烯醇化酶
(九)甲状腺球蛋白和降钙素
(十)血型抗原

第十三章 消化器官免疫细胞化学

  第一节 胃肠道粘膜免疫细胞化学特点

    一、抗原的稳定性
二、抗体的特异性
三、染色技术的特异性
四、结果的可比性

  第二节 胃肠道粘膜抗体产生细胞

    一、抗体产生细胞的特点
二、双标记免疫荧光染色
三、临床意义

  第三节 消化道分泌性lgA

    一、SlgA合成及其功能
二、对比免疫荧光染色
三、临床意义

  第四节 胃肠道粘膜T淋巴细胞

    一、T淋巴细胞分布及其特点
二、研究方法
三、临床意义

  第五节 癌胚抗原的免疫细胞化学

    一、癌胚抗原的特点
二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色
三、临床意义

  第六节 胃肠道溶菌酶

    一、溶菌酶在胃肠道的分布
二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点
三、溶菌酶研究的临床意义

  第七节 消化管壁内神经丛的免疫细胞化学

    一、内源性神经的结构

      (一)神经丛的模式
(二)神经元的数目和大小
(三)神经细胞的类型

    二、消化道全层铺片技术

  第八节 肝脏疾病免疫细胞化学

    一、乙型肝炎免疫细胞化学

      (一)乙型肝炎的免疫反应发病机理
(二)乙型肝炎与自身免疫反应
(三)乙型肝炎细胞内病毒抗原的定位及分布

    二、肝硬变免疫细胞化学

      (一)肝硬变组织内HBV抗原的定位及分布
(二)肝硬变组织内纤维结合蛋白(FN)的定位及分布
(三)肝硬变组织内Ⅲ型胶原的定位及分布
(四)肝硬变组织内角蛋白定位及分布

    三、肝癌免疫细胞化学

      (一)HBV与原发性肝瘤的流行病学证据
(二)肝硬变与肝癌的关系
(三)肝细胞肝癌及癌周肝细胞内HBV抗原的分布
(四)肝内胆管细胞及癌周肝组织内HBV抗原的分布
(五)肝细胞癌中的HBV的分子生物学
(六)肝癌发生中HBV分子遗传学及免疫机理

第十四章 肾脏疾病免疫细胞化学

  第一节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中的应用范围

    一、肾脏组织的检查

      (一)免疫荧光细胞化学技术的应用
(二)免疫酶标细胞化学技术的应用
(三)电镜免疫细胞化学技术的应用

    二、血清或肾脏洗脱液的检查
三、尿液的检查
四、肾小球细胞的体外培养

  第二节 荧光或酶标抗体在肾脏内显示的部位及形式

    一、肾小球毛细血管壁
二、肾小球系膜区
三、肾小球毛细血管壁及系膜区
    四、新月体内
    五、肾小球囊腔
    六、肾小管
    七、小动脉
    八、肾间质

  第三节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中应用的意义

    一、免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中应用的意义

      (一)肾小球疾病发病机制的研究
(二)判断肾脏疾病是否为免疫性疾病
(三)有助于某些肾小球疾病的确诊
(四)其他

    二、免疫电镜技术在肾脏疾病中应用的意义

  第四节 各种肾脏疾病的病变以及免疫荧光(酶标)表现特征

    一、原


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