抑癌基因OPCML的克隆及其在卵巢癌中的功能研究
http://www.100md.com
参见附件(194KB)。
姚德生 1 李 力 1 Kenneth Garson 2 Barbara C. Vanderhyden 2
1 广西医科大学肿瘤医院妇瘤科
2 加拿大渥太华大学癌症中心
本项目研究获美国 NIH 研究基金 (CA84242) 、加拿大国家癌症研究基金 (NCIC 014175) 和广西回国基金 ( 桂科回 0575020) 资助
【摘要】目的 为了解 OPCML 在卵巢癌中的功能 , 以及慢病毒载体( lentiviral vector )作为体外转基因工具的高效性和可行性。 方法 根据 GenBank 上的序列，从 CD1 小鼠上克隆了 OPCML 基因，将之克隆到慢病毒载体 pWPI-GFP ，构建了慢病毒表达质粒 pWPI-OPCML ，将 pWPI-OPCML+pCMV.dR874 +pMDG 共转染 293T 细胞获得携带有 OPCML 的重组慢病毒，用病毒上清感染靶细胞( A2780 ， OCC1 ， RM 及 MOSE )，通过细胞增殖试验、细胞聚合力试验及体内成瘤试验等来研究 OPCML 在卵巢癌中的功能。 结果 ( 1 ) OPCML 能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞，效率几乎达 100% ，同时达到稳定的表达， Western blot 能检测到 OPCML(60kDa) 和 GFP(27kDa) 蛋白。 ( 2 ) 细胞增殖试验显示，在 A2780 和 RM 细胞，转入 OPCML 后细胞的增殖明显的比未转基因( A2780 ， RM )或仅转空载体( A2780-pWPI 和 RM-PWPI )者慢( P <0.01 )，但在 OCC1 细胞系， OPCML 对细胞的增殖无明显的影响( P >0.05 )；( 3 ) FCM (流式细胞仪)对细胞周期检测显示 OPCML 对 A2780 细胞的细胞周期有明显的滞留作用，但对 OCC1 、 RM 、 MOSE 细胞无明显滞留作用( P >0.05 )；( 4 )细胞聚合力试验显示 OPCML 能明显增强细胞的粘附力；( 5 )移植瘤试验显示，将 A2780-OPCML 注射到裸皮下，仅有一个( 1/4 )有肿瘤生长，体积显著的小于 A2780 及 A2780-pWPI 组( P <0.001 ) ; 但在 RM 组， RM-OPCML 和对照组 RM-pWPI 之间肿瘤大小和成瘤情况无明显差异( P >0.05 )。 结论 重组的慢病毒作为转基因的工具，具有高效，同时能使目的基因达到持续稳定的表达； OPCML 能够抑制 A2780 ， RM 生长； OPCML 能够增加细胞的粘附能力，抑制肿瘤的转移；在体内能肿瘤的形成和生长，可能是一个新的抑癌基因。
【关键词】 慢病毒载体； 卵巢癌； OPCML ； 基因转移； 移植瘤模型
【 Abstract 】 Objective To study the function of OPCML in ovarian cancer , also check the reliability of lentiviral vector transgene system. Methods OPCML gene was cloned from CD1 mouse according to the sequence in GenBank., and subcloned to a lentiviral vector pWPI-GFP, constructed the lentivirus expressional plasmid pWPI-OPCML. Recombinant lentiviruses that carrying OPCML were produced by co-transfection of pWPI-OPCML+pCMV -dR874 +pMDG to 293T, then infected ovarian cancer cell lines (A2780, OCC1, RM et al) by recombinant lentiviruses. Observed the phenotypic characteristics by cell proliferation assay, cell Aggregation assay in vivo and xenograft assay in vivo. Results (1) OPCML can be transfer to target cells by Recombinant lentiviruses, the infection efficiency was nearly 100%; OPCML(60kDa) and GFP(27kDa) protein can be expressed stable and detected by Western blot in target cells; (2) Cell proliferation assay showed A2780-OPCML and RM-OPCML grow slowly comparing to parent cells that only tranfered empty vector(pWPI-GFP) ( P <0.01 ) , but there is no difference in OCC1 and the normal MOSE ( P >0.05 ) . (3) FCM assay showed OPCML can arrest cell cycle in A2780 cell line ( P <0.05); but in RM, OCC1, MOSE cell lines, OPCML can't influence the cell cycles. (4) Cell aggregation assay showed ， OPCML can enhance the ability of adhesion; (5) Xenograft experiment showed A2780-OPCML only 1/4 nude mice can formated tumor, the tumor is also smaller compared to A2780 and A2780-pWPI( P <0.001); but for the RM-OPCML and RM-pWPI, they don't have any difference ( P >0.05 ) . OPCML protein can be detected by immunohistichemical staining in the tumor tissue. Conclusions Recombinant lentiviruses have high infection efficiency, the OPCML can be deliveried and expressed stable; OPCML can enhance the ability of adhesion, inhibit A2780 proliferation and tumor formation. OPCML should be a new tumor suppressor gene.
【 Key Words 】 Lentiviral vector; Ovarian cancer; OPCML; Gene transfer; Xenograft model
OPCML (Opioid-binding protein/cell adhesion molecule-like ) ，也称 OBCAM (Opioid -binding protein/ cell adhesion molecule) ，定位于人染色体 11q25 ，在这个区域常常发现有杂合子的缺失( LOH )。 OPCML 与肿瘤的关系目前了解不多，有人认为可能是一个抑癌基因。为了进一步了解 OPCML 在卵巢癌中所扮演的角色，我们通过从正常组织中克隆 OPCML 基因，利用慢病毒载体( lentiviral vector )转基因系统，将 OPCML 转导入卵巢癌细胞，研究转基因前后细胞生物学特性的变化，同时了解所建立的慢病毒转基因系统在转基因工程中的可行性和优点。
一、材料和方法
(一) PCML 基因的克隆及表达质粒的构建
1 .引物
从 GenBank 中找到 OPCML 的全长序列，用计算机软件 Vector NTI 找出 ORF ，同时设计扩增 ORF 的 PCR 引物，为了增强其转录能力和易于导入，于引物前端加入 Kozaki 序列( GCCGCCACC )和 SpeI 酶切位点( ACTAGT )，引物序列为 Forward5'- GGGACTAGTGCC GCCACCATGGGGGTCTGTGGGTACCT ， Reverse5'- GGGACTAGTCGATGCTCAGAGGACC TATG 。
2 . OPCML 基因的克隆
从 CD1 小白鼠脑组织( OPCML 含量最为丰富)，用 RNeasy R Mini kit 250(Qiagen) 按厂家操作规程提取总 RNA ；用 Oligo(dT)12~18 and 和 superscript TM II RT (invitrogen) 将 mRNA 逆转录为 cDNA ； PCR 扩增该片段， DNA 聚合酶为 Pfu polymerase (Stratagene) ，反应条件为热启动 95 o C 2min ，变性 95 o C 45s ，复性 55 o C 60s ，延伸 72 o C 90s ， 35 个循环，最后 72C 聚合 3min ，扩增产物用 0.8% 低熔点琼脂糖凝胶电脉分离纯化， 1093bp 片段为 OPCML ；在紫外灯下将该片段从凝胶上切下，用 QIAquick Gel Extraction kit 按厂家操作规程将 DNA 从凝胶中回收。
3 . OPCML 基因表达质粒 pcDNA3-OPCML 的构建
用 T 4 DNA Polymerase 将从凝胶中回收的 OPCML DNA 片段修复为平末端和磷酸化，以利于导入表达载体。用 QIAquick Gel Extraction kit(Qiagen) 按厂家操作规程将 DNA 从反应液中回收。用内切酶 BamH1 将载体 pcDNA3 于多克隆位点切开，变为平末端，用虾碱性磷酸酶( SAP )将其去磷酸化，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离， QIAquick Gel Extraction kit 按厂家操作规程将 DNA 从凝胶中回收，测定其浓度。将磷酸化后的 OPCML 和线性去磷酸化的 pcDNA3 在 T4DNA 连接酶( Invitrogen )的作用下连接，后转化 DH5α 大肠杆菌，种植于含氨苄青霉素的 LB 琼脂糖培养基中， 37℃ 培养过夜，挑选单个克隆培养于 5ml 含氨苄青霉素的 LB 中于 37℃ 恒温摇床振荡 10~16h ；用克隆时的引物作 PCR ，筛选阳性克隆。将阳性克隆置于 500ml 含氨苄青霉素的 LB 中， 37℃ 恒温摇床振荡培养 16~20h ，用 QIAprep Spin Miniprep Kit 试剂盒提取质粒 DNA ，酶切证实。
4 .测序
测定质粒 DNA 的序列，与 GenBank 中正常 OPCML ORF 序列比较，序列完全完全正常者称为 pcDNA3-OPCML 。
5 . Western blot 检测 OPCML 蛋白表达
用 FuGEN-6 转染试剂盒( Roche )按厂家厂家提供的操作将 pcDNA3-OPCML 转染 293T 细胞，用 Western blot 检测 OPCML 蛋白质的表达。一抗为鸡抗 OPCML 的 IgY 的单克隆抗体(英国爱丁堡大学 Eric Miller 博士惠赠， 1∶4000 倍稀释)，二抗为 Goat polyclonal to chicken IgY H&L (HRP) Pre-adsorbed (Abcam) ， 1∶2000 倍稀释。结果：在 293T 中可检测到 60kDa 的 OPCML 蛋白质的表达 ( 见图 1) 。
A: 转染 pcDNA3-OPCML; B: 空白对照； Tubulin 为内对照
图 1 Western blot 检测 293T 细胞 OPCML 蛋白质的表达结果
(二) OPCML 慢病毒表达质粒的构建
1 .将 OPCML 克隆到慢病毒载体 pWPI-GFP
pWPI-GFP 由 Trono 博士惠赠。将 pWPI-GFP 用内切切酶 PmeI 切开(平末端)， SAP 去磷酸化， 0.6% 低熔点琼脂糖凝胶纯化，用 QIAquick Gel Extraction kit 按厂家操作规程将 DNA 从凝胶中回收。用内切酶 SpeI 酶切 pcDNA3-OPCML ，将 OPCML 切下，琼脂糖凝胶分离纯化， 1081bp 片段为 OPCML ，用 QIAquick Gel Extraction kit 回收该片段，用 T 4 DNA 聚合酶将粘末端修复为平末端，测定浓度( 48ng/ul )。用 T 4 DNA 连接酶将 OPCML 和线性 pWPI-GFP 连接，转化 DH5α 大肠杆菌，后种植于含氨苄青霉素的 LB 琼脂糖培养基中， 37℃ 培养过夜，筛选阳性克隆( pWPI-OPCML )，后用 500ml 含氨苄青霉素的 LB 培养游液扩增转化菌，用试剂盒( QIAGEN Plasmid Maxi kit )按厂家提供的方法提取质粒 pWPI-OPCML 的 DNA 。
2 . pWPI-OPCML 质粒表达 GFP 和 OPCML 蛋白测定
将 pWPI-OPCML 用 FuGENE-6 试剂盒同前转染 293T 细胞，于转染 24h 后在荧光显微镜下可观察绿色荧光 GFP ， Western blot 可检测到 OPCML 蛋白质的表达 ( 见图 2) 。......（后略) ......
姚德生 1 李 力 1 Kenneth Garson 2 Barbara C. Vanderhyden 2
1 广西医科大学肿瘤医院妇瘤科
2 加拿大渥太华大学癌症中心
本项目研究获美国 NIH 研究基金 (CA84242) 、加拿大国家癌症研究基金 (NCIC 014175) 和广西回国基金 ( 桂科回 0575020) 资助
【摘要】目的 为了解 OPCML 在卵巢癌中的功能 , 以及慢病毒载体( lentiviral vector )作为体外转基因工具的高效性和可行性。 方法 根据 GenBank 上的序列，从 CD1 小鼠上克隆了 OPCML 基因，将之克隆到慢病毒载体 pWPI-GFP ，构建了慢病毒表达质粒 pWPI-OPCML ，将 pWPI-OPCML+pCMV.dR874 +pMDG 共转染 293T 细胞获得携带有 OPCML 的重组慢病毒，用病毒上清感染靶细胞( A2780 ， OCC1 ， RM 及 MOSE )，通过细胞增殖试验、细胞聚合力试验及体内成瘤试验等来研究 OPCML 在卵巢癌中的功能。 结果 ( 1 ) OPCML 能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞，效率几乎达 100% ，同时达到稳定的表达， Western blot 能检测到 OPCML(60kDa) 和 GFP(27kDa) 蛋白。 ( 2 ) 细胞增殖试验显示，在 A2780 和 RM 细胞，转入 OPCML 后细胞的增殖明显的比未转基因( A2780 ， RM )或仅转空载体( A2780-pWPI 和 RM-PWPI )者慢( P <0.01 )，但在 OCC1 细胞系， OPCML 对细胞的增殖无明显的影响( P >0.05 )；( 3 ) FCM (流式细胞仪)对细胞周期检测显示 OPCML 对 A2780 细胞的细胞周期有明显的滞留作用，但对 OCC1 、 RM 、 MOSE 细胞无明显滞留作用( P >0.05 )；( 4 )细胞聚合力试验显示 OPCML 能明显增强细胞的粘附力；( 5 )移植瘤试验显示，将 A2780-OPCML 注射到裸皮下，仅有一个( 1/4 )有肿瘤生长，体积显著的小于 A2780 及 A2780-pWPI 组( P <0.001 ) ; 但在 RM 组， RM-OPCML 和对照组 RM-pWPI 之间肿瘤大小和成瘤情况无明显差异( P >0.05 )。 结论 重组的慢病毒作为转基因的工具，具有高效，同时能使目的基因达到持续稳定的表达； OPCML 能够抑制 A2780 ， RM 生长； OPCML 能够增加细胞的粘附能力，抑制肿瘤的转移；在体内能肿瘤的形成和生长，可能是一个新的抑癌基因。
【关键词】 慢病毒载体； 卵巢癌； OPCML ； 基因转移； 移植瘤模型
【 Abstract 】 Objective To study the function of OPCML in ovarian cancer , also check the reliability of lentiviral vector transgene system. Methods OPCML gene was cloned from CD1 mouse according to the sequence in GenBank., and subcloned to a lentiviral vector pWPI-GFP, constructed the lentivirus expressional plasmid pWPI-OPCML. Recombinant lentiviruses that carrying OPCML were produced by co-transfection of pWPI-OPCML+pCMV -dR874 +pMDG to 293T, then infected ovarian cancer cell lines (A2780, OCC1, RM et al) by recombinant lentiviruses. Observed the phenotypic characteristics by cell proliferation assay, cell Aggregation assay in vivo and xenograft assay in vivo. Results (1) OPCML can be transfer to target cells by Recombinant lentiviruses, the infection efficiency was nearly 100%; OPCML(60kDa) and GFP(27kDa) protein can be expressed stable and detected by Western blot in target cells; (2) Cell proliferation assay showed A2780-OPCML and RM-OPCML grow slowly comparing to parent cells that only tranfered empty vector(pWPI-GFP) ( P <0.01 ) , but there is no difference in OCC1 and the normal MOSE ( P >0.05 ) . (3) FCM assay showed OPCML can arrest cell cycle in A2780 cell line ( P <0.05); but in RM, OCC1, MOSE cell lines, OPCML can't influence the cell cycles. (4) Cell aggregation assay showed ， OPCML can enhance the ability of adhesion; (5) Xenograft experiment showed A2780-OPCML only 1/4 nude mice can formated tumor, the tumor is also smaller compared to A2780 and A2780-pWPI( P <0.001); but for the RM-OPCML and RM-pWPI, they don't have any difference ( P >0.05 ) . OPCML protein can be detected by immunohistichemical staining in the tumor tissue. Conclusions Recombinant lentiviruses have high infection efficiency, the OPCML can be deliveried and expressed stable; OPCML can enhance the ability of adhesion, inhibit A2780 proliferation and tumor formation. OPCML should be a new tumor suppressor gene.
【 Key Words 】 Lentiviral vector; Ovarian cancer; OPCML; Gene transfer; Xenograft model
OPCML (Opioid-binding protein/cell adhesion molecule-like ) ，也称 OBCAM (Opioid -binding protein/ cell adhesion molecule) ，定位于人染色体 11q25 ，在这个区域常常发现有杂合子的缺失( LOH )。 OPCML 与肿瘤的关系目前了解不多，有人认为可能是一个抑癌基因。为了进一步了解 OPCML 在卵巢癌中所扮演的角色，我们通过从正常组织中克隆 OPCML 基因，利用慢病毒载体( lentiviral vector )转基因系统，将 OPCML 转导入卵巢癌细胞，研究转基因前后细胞生物学特性的变化，同时了解所建立的慢病毒转基因系统在转基因工程中的可行性和优点。
一、材料和方法
(一) PCML 基因的克隆及表达质粒的构建
1 .引物
从 GenBank 中找到 OPCML 的全长序列，用计算机软件 Vector NTI 找出 ORF ，同时设计扩增 ORF 的 PCR 引物，为了增强其转录能力和易于导入，于引物前端加入 Kozaki 序列( GCCGCCACC )和 SpeI 酶切位点( ACTAGT )，引物序列为 Forward5'- GGGACTAGTGCC GCCACCATGGGGGTCTGTGGGTACCT ， Reverse5'- GGGACTAGTCGATGCTCAGAGGACC TATG 。
2 . OPCML 基因的克隆
从 CD1 小白鼠脑组织( OPCML 含量最为丰富)，用 RNeasy R Mini kit 250(Qiagen) 按厂家操作规程提取总 RNA ；用 Oligo(dT)12~18 and 和 superscript TM II RT (invitrogen) 将 mRNA 逆转录为 cDNA ； PCR 扩增该片段， DNA 聚合酶为 Pfu polymerase (Stratagene) ，反应条件为热启动 95 o C 2min ，变性 95 o C 45s ，复性 55 o C 60s ，延伸 72 o C 90s ， 35 个循环，最后 72C 聚合 3min ，扩增产物用 0.8% 低熔点琼脂糖凝胶电脉分离纯化， 1093bp 片段为 OPCML ；在紫外灯下将该片段从凝胶上切下，用 QIAquick Gel Extraction kit 按厂家操作规程将 DNA 从凝胶中回收。
3 . OPCML 基因表达质粒 pcDNA3-OPCML 的构建
用 T 4 DNA Polymerase 将从凝胶中回收的 OPCML DNA 片段修复为平末端和磷酸化，以利于导入表达载体。用 QIAquick Gel Extraction kit(Qiagen) 按厂家操作规程将 DNA 从反应液中回收。用内切酶 BamH1 将载体 pcDNA3 于多克隆位点切开，变为平末端，用虾碱性磷酸酶( SAP )将其去磷酸化，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离， QIAquick Gel Extraction kit 按厂家操作规程将 DNA 从凝胶中回收，测定其浓度。将磷酸化后的 OPCML 和线性去磷酸化的 pcDNA3 在 T4DNA 连接酶( Invitrogen )的作用下连接，后转化 DH5α 大肠杆菌，种植于含氨苄青霉素的 LB 琼脂糖培养基中， 37℃ 培养过夜，挑选单个克隆培养于 5ml 含氨苄青霉素的 LB 中于 37℃ 恒温摇床振荡 10~16h ；用克隆时的引物作 PCR ，筛选阳性克隆。将阳性克隆置于 500ml 含氨苄青霉素的 LB 中， 37℃ 恒温摇床振荡培养 16~20h ，用 QIAprep Spin Miniprep Kit 试剂盒提取质粒 DNA ，酶切证实。
4 .测序
测定质粒 DNA 的序列，与 GenBank 中正常 OPCML ORF 序列比较，序列完全完全正常者称为 pcDNA3-OPCML 。
5 . Western blot 检测 OPCML 蛋白表达
用 FuGEN-6 转染试剂盒( Roche )按厂家厂家提供的操作将 pcDNA3-OPCML 转染 293T 细胞，用 Western blot 检测 OPCML 蛋白质的表达。一抗为鸡抗 OPCML 的 IgY 的单克隆抗体(英国爱丁堡大学 Eric Miller 博士惠赠， 1∶4000 倍稀释)，二抗为 Goat polyclonal to chicken IgY H&L (HRP) Pre-adsorbed (Abcam) ， 1∶2000 倍稀释。结果：在 293T 中可检测到 60kDa 的 OPCML 蛋白质的表达 ( 见图 1) 。
A: 转染 pcDNA3-OPCML; B: 空白对照； Tubulin 为内对照
图 1 Western blot 检测 293T 细胞 OPCML 蛋白质的表达结果
(二) OPCML 慢病毒表达质粒的构建
1 .将 OPCML 克隆到慢病毒载体 pWPI-GFP
pWPI-GFP 由 Trono 博士惠赠。将 pWPI-GFP 用内切切酶 PmeI 切开(平末端)， SAP 去磷酸化， 0.6% 低熔点琼脂糖凝胶纯化，用 QIAquick Gel Extraction kit 按厂家操作规程将 DNA 从凝胶中回收。用内切酶 SpeI 酶切 pcDNA3-OPCML ，将 OPCML 切下，琼脂糖凝胶分离纯化， 1081bp 片段为 OPCML ，用 QIAquick Gel Extraction kit 回收该片段，用 T 4 DNA 聚合酶将粘末端修复为平末端，测定浓度( 48ng/ul )。用 T 4 DNA 连接酶将 OPCML 和线性 pWPI-GFP 连接，转化 DH5α 大肠杆菌，后种植于含氨苄青霉素的 LB 琼脂糖培养基中， 37℃ 培养过夜，筛选阳性克隆( pWPI-OPCML )，后用 500ml 含氨苄青霉素的 LB 培养游液扩增转化菌，用试剂盒( QIAGEN Plasmid Maxi kit )按厂家提供的方法提取质粒 pWPI-OPCML 的 DNA 。
2 . pWPI-OPCML 质粒表达 GFP 和 OPCML 蛋白测定
将 pWPI-OPCML 用 FuGENE-6 试剂盒同前转染 293T 细胞，于转染 24h 后在荧光显微镜下可观察绿色荧光 GFP ， Western blot 可检测到 OPCML 蛋白质的表达 ( 见图 2) 。......（后略) ......
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