三维肿瘤生物模型的创建--从体外肿瘤生物学研究到临床应用
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参见附件(119kb)。
上海瑞金医院集团闵行医院 刘 华 杨 炜
【摘要】 本文揭示一种在体外构建肿瘤的方法以及采用所述方法获得的体外肿瘤生物模型。所述方法包括将肿瘤细胞置于我们发明的三维细胞培养单元中，使肿瘤细胞生长并在体外构建实体肿瘤。本方法为肿瘤细胞提供了近似于体内生长和运动的理想的三维环境。首次实现在离体条件下构建肿瘤。所构建的肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的细胞生物学特性并可分泌肿瘤相关抗原。所述方法可随时动态观察肿瘤细胞和肿瘤的生长、分化、移行、运动、浸润、转移或凋亡等特性。所述体外肿瘤模型为癌症的研究提供了独特的环境，可实施各种针对特定肿瘤的基础和临床研究。对肿瘤的指导预防、辅助诊断、改进治疗和评估预后等方面的研究将提供宝贵的作用。
【关键词】 肿瘤生物学； 转移和浸润； 三维肿瘤生物模型
肿瘤占世界和我国人口死亡率第二位。为攻克肿瘤，许多发达国家花费巨额资金和大量人力进行研究，但目前每年全世界至少有 700 万人死于癌症，其中我国约 130 万。因此癌症的防治与研究具有十分重要的意义 [1] 。
肿瘤的体外研究主要依靠二维培养各种肿瘤细胞系或株或原代肿瘤细胞来进行，但其结果并不能真正反映呈三维状态生长的肿瘤。为了克服肿瘤单层细胞培养的缺点，有些研究者采用了多细胞的圆球体作为体外肿瘤模型 [2] 。但由于只有部分肿瘤细胞株可以在培养条件下自发性的生长形成肿瘤圆球体，肿瘤多细胞圆球体要依靠低速度的离心力，持续旋转的培养皿，或者是借助于培养液中的化学物质才能形成。所以肿瘤多细胞圆球体并不是一个真正的肿瘤的自然聚积生长过程。另外多细胞的肿瘤圆球体模型也很难直接用于肿瘤的侵袭和转移的研究。另一可供选择的方法是将肿瘤细胞株接种到裸鼠中，观测其三维组织结构的形态和功能。裸鼠动物实验成本较高，耗时较长，受影响因素较多，而且不利于连续动态观察。这使其应用价值受到了一定的限制。
肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的生物学特征之一。临床肿瘤转移的发生率相当高，据统计 60% 以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。肿瘤侵袭和转移是肿瘤发生和演进过程中最危险阶段。肿瘤患者约有 80% 以上死于侵袭和转移。因此肿瘤转移是一个十分令人关注的临床治疗的难题。
目前，很难直接从哺乳动物体内观察到恶性肿瘤的浸润和转移的全过程。动物的自发性肿瘤在短期内出现转移的也不多。因此，迫切需要开发一种具与哺乳动物体内的肿瘤有相同特性的、可方便地用于肿瘤浸润和转移研究以及药物筛选的体外实体肿瘤模型。
一、材料与方法
所用肿瘤细胞株均来源于人类：肝癌细胞株 SMMC 7721 ，肝癌细胞株 ATCC HB-8065 ，结肠癌细胞株 ATCC CCL-209 ，卵巢癌细胞株 ATCC HTB-161 ，乳腺癌细胞株 ATCC HTB-22 ，小细胞肺癌细胞株 ATCC HTB-171 。
采用本装置培养肿瘤细胞之前将肿瘤细胞按照通常的方法培养至细胞长满到 80% ～ 90% 时消化，消化后的肿瘤细胞置于三维细胞培养单元中，再将其放入所需的液体培养基中，然后放于常规的二氧化碳培养箱中培养，使肿瘤细胞生长形成肿瘤。
为观察化学治疗药物的作用，我们将结肠癌细胞株 (LOVO, ATCC CCL-229) 置于三维细胞培养单元中，使肿瘤细胞生长形成肿瘤。然后将化学治疗药物乐沙定直接放入所述的结肠癌模型的培养基中， 48 小时后比较在使用化学治疗药物前后肿瘤细胞的生长状况。同时测定细胞培养液中的癌胚抗原的浓度变化。未加入乐沙定的结肠癌模型作为对照。
二、结果
体外培养所获得的肿瘤生物模型具有与体内恶性肿瘤相似的生物学和细胞学特性。培养装置中的恶性肿瘤细胞可形成类似于原位癌的微小癌。所形成的恶性肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的生长状态和细胞生物学特性。表现为肿瘤细胞的快速生长、呈无限制性增生、早期出现中央性坏死、肿瘤的结构包含有一个活跃增生的外层细胞以及一个较为松散含有许多死亡的和正在死亡细胞的中央。 ( 图 1A-B)
A B
图 1
图 1A 结肠癌细胞株， 1B 肝癌细胞株 8065 。体外培养所获得的肿瘤生物模型具有与体内恶性肿瘤相似的生物学和细胞学特性。表现为肿瘤细胞的快速生长、早期出现中央性坏死、肿瘤的结构包含有一个活跃增生的外层细胞以及一个较为松散含有许多死亡的和正在死亡细胞的中央。放大倍数为 20×
在显微镜下可观察到；各种肿瘤有与其来源类似的特性。如小细胞性肺癌呈圆球形，结肠癌表现为菜花状或不规则结节。更重要的是，这一体外肿瘤模型处于生长和功能活性状态达几个月之久。而且可以分泌与临床观察所一致的肿瘤相关抗原，如肝癌分泌 AFP ，结肠癌分泌癌胚抗原，和卵巢癌分泌癌抗原 125 。 ( 图 2A-D, 图 3)
A B C D
图 2
图 2A 小细胞肺癌细胞株， 2B 结肠癌细胞株， 2C 卵巢癌细胞株， 2D 肝癌细胞株 7721 。各种肿瘤有与其来源类似的特性。如小细胞性肺癌呈圆球形，结肠癌表现为菜花状或不规则结节。放大倍数依次为 20×10×40×10×
图 3
在显微镜下还可观察到；细胞有微绒毛和足突的形成、包括叶状和丝状伪足；还可观察到所构建的肿瘤的浸润和转移，如细胞的播散和种植、穿透性浸润、运动和 / 或脱落至肿瘤周围。 ( 图 4A-D)
A B C D
图 4
图 4A 小细胞肺癌细胞株， 4B 肝癌细胞株 7721 ， 4C 结肠癌细胞株， 4D 卵巢癌细胞株。在显微镜下可观察到；细胞有微绒毛和足突的形成、包括叶状和丝状伪足；可观察到肿瘤的浸润和转移，如细胞的播散和种植、穿透性浸润、运动和 / 或脱落至肿瘤周围。放大倍数依次为 4 0 × 4 0 × 1 0 × 4 0 ×
不同类型的肿瘤有不同的生物学特性。如其发生侵袭和转移的时间、频率和程度等的不同。如肝癌细胞株 7721 发生侵袭和转移的时间早、其频率和程度均明显大于乳腺癌细胞株 22 。可见细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移、黏附于基质并呈克隆性生长形成多发性转移性肿瘤。有时可见大量细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移，呈克隆性生长并形成多个继发性肿瘤。 ( 图 5A-B)
A B
图 5
图 5A 乳腺癌细胞株， 5B 肝癌细胞株 7721 。不同类型的肿瘤有不同的生物学特性。肝癌细胞株 7721 发生侵袭和转移的时间早、频率和程度均明显大于乳腺癌细胞株 22 。可见细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移、黏附于基质并呈克隆性生长形成多发性转移性肿瘤。放大倍数为 2 0 × 。
不同类型的肿瘤亦表现出明显不同程度的细胞凋亡。在我们所观察的肿瘤细胞模型中，卵巢癌发生细胞凋亡的程度最为显著。 ( 图 6A-B)
A B
图 6
图 6A 乳腺癌细胞株， 5B 卵巢癌细胞株。在我们所观察的肿瘤细胞模型中，卵巢癌 161 发生细胞凋亡的程度最为显著。放大倍数依次为 20×40× ......
上海瑞金医院集团闵行医院 刘 华 杨 炜
【摘要】 本文揭示一种在体外构建肿瘤的方法以及采用所述方法获得的体外肿瘤生物模型。所述方法包括将肿瘤细胞置于我们发明的三维细胞培养单元中，使肿瘤细胞生长并在体外构建实体肿瘤。本方法为肿瘤细胞提供了近似于体内生长和运动的理想的三维环境。首次实现在离体条件下构建肿瘤。所构建的肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的细胞生物学特性并可分泌肿瘤相关抗原。所述方法可随时动态观察肿瘤细胞和肿瘤的生长、分化、移行、运动、浸润、转移或凋亡等特性。所述体外肿瘤模型为癌症的研究提供了独特的环境，可实施各种针对特定肿瘤的基础和临床研究。对肿瘤的指导预防、辅助诊断、改进治疗和评估预后等方面的研究将提供宝贵的作用。
【关键词】 肿瘤生物学； 转移和浸润； 三维肿瘤生物模型
肿瘤占世界和我国人口死亡率第二位。为攻克肿瘤，许多发达国家花费巨额资金和大量人力进行研究，但目前每年全世界至少有 700 万人死于癌症，其中我国约 130 万。因此癌症的防治与研究具有十分重要的意义 [1] 。
肿瘤的体外研究主要依靠二维培养各种肿瘤细胞系或株或原代肿瘤细胞来进行，但其结果并不能真正反映呈三维状态生长的肿瘤。为了克服肿瘤单层细胞培养的缺点，有些研究者采用了多细胞的圆球体作为体外肿瘤模型 [2] 。但由于只有部分肿瘤细胞株可以在培养条件下自发性的生长形成肿瘤圆球体，肿瘤多细胞圆球体要依靠低速度的离心力，持续旋转的培养皿，或者是借助于培养液中的化学物质才能形成。所以肿瘤多细胞圆球体并不是一个真正的肿瘤的自然聚积生长过程。另外多细胞的肿瘤圆球体模型也很难直接用于肿瘤的侵袭和转移的研究。另一可供选择的方法是将肿瘤细胞株接种到裸鼠中，观测其三维组织结构的形态和功能。裸鼠动物实验成本较高，耗时较长，受影响因素较多，而且不利于连续动态观察。这使其应用价值受到了一定的限制。
肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的生物学特征之一。临床肿瘤转移的发生率相当高，据统计 60% 以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。肿瘤侵袭和转移是肿瘤发生和演进过程中最危险阶段。肿瘤患者约有 80% 以上死于侵袭和转移。因此肿瘤转移是一个十分令人关注的临床治疗的难题。
目前，很难直接从哺乳动物体内观察到恶性肿瘤的浸润和转移的全过程。动物的自发性肿瘤在短期内出现转移的也不多。因此，迫切需要开发一种具与哺乳动物体内的肿瘤有相同特性的、可方便地用于肿瘤浸润和转移研究以及药物筛选的体外实体肿瘤模型。
一、材料与方法
所用肿瘤细胞株均来源于人类：肝癌细胞株 SMMC 7721 ，肝癌细胞株 ATCC HB-8065 ，结肠癌细胞株 ATCC CCL-209 ，卵巢癌细胞株 ATCC HTB-161 ，乳腺癌细胞株 ATCC HTB-22 ，小细胞肺癌细胞株 ATCC HTB-171 。
采用本装置培养肿瘤细胞之前将肿瘤细胞按照通常的方法培养至细胞长满到 80% ～ 90% 时消化，消化后的肿瘤细胞置于三维细胞培养单元中，再将其放入所需的液体培养基中，然后放于常规的二氧化碳培养箱中培养，使肿瘤细胞生长形成肿瘤。
为观察化学治疗药物的作用，我们将结肠癌细胞株 (LOVO, ATCC CCL-229) 置于三维细胞培养单元中，使肿瘤细胞生长形成肿瘤。然后将化学治疗药物乐沙定直接放入所述的结肠癌模型的培养基中， 48 小时后比较在使用化学治疗药物前后肿瘤细胞的生长状况。同时测定细胞培养液中的癌胚抗原的浓度变化。未加入乐沙定的结肠癌模型作为对照。
二、结果
体外培养所获得的肿瘤生物模型具有与体内恶性肿瘤相似的生物学和细胞学特性。培养装置中的恶性肿瘤细胞可形成类似于原位癌的微小癌。所形成的恶性肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的生长状态和细胞生物学特性。表现为肿瘤细胞的快速生长、呈无限制性增生、早期出现中央性坏死、肿瘤的结构包含有一个活跃增生的外层细胞以及一个较为松散含有许多死亡的和正在死亡细胞的中央。 ( 图 1A-B)
A B
图 1
图 1A 结肠癌细胞株， 1B 肝癌细胞株 8065 。体外培养所获得的肿瘤生物模型具有与体内恶性肿瘤相似的生物学和细胞学特性。表现为肿瘤细胞的快速生长、早期出现中央性坏死、肿瘤的结构包含有一个活跃增生的外层细胞以及一个较为松散含有许多死亡的和正在死亡细胞的中央。放大倍数为 20×
在显微镜下可观察到；各种肿瘤有与其来源类似的特性。如小细胞性肺癌呈圆球形，结肠癌表现为菜花状或不规则结节。更重要的是，这一体外肿瘤模型处于生长和功能活性状态达几个月之久。而且可以分泌与临床观察所一致的肿瘤相关抗原，如肝癌分泌 AFP ，结肠癌分泌癌胚抗原，和卵巢癌分泌癌抗原 125 。 ( 图 2A-D, 图 3)
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图 2
图 2A 小细胞肺癌细胞株， 2B 结肠癌细胞株， 2C 卵巢癌细胞株， 2D 肝癌细胞株 7721 。各种肿瘤有与其来源类似的特性。如小细胞性肺癌呈圆球形，结肠癌表现为菜花状或不规则结节。放大倍数依次为 20×10×40×10×
图 3
在显微镜下还可观察到；细胞有微绒毛和足突的形成、包括叶状和丝状伪足；还可观察到所构建的肿瘤的浸润和转移，如细胞的播散和种植、穿透性浸润、运动和 / 或脱落至肿瘤周围。 ( 图 4A-D)
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图 4
图 4A 小细胞肺癌细胞株， 4B 肝癌细胞株 7721 ， 4C 结肠癌细胞株， 4D 卵巢癌细胞株。在显微镜下可观察到；细胞有微绒毛和足突的形成、包括叶状和丝状伪足；可观察到肿瘤的浸润和转移，如细胞的播散和种植、穿透性浸润、运动和 / 或脱落至肿瘤周围。放大倍数依次为 4 0 × 4 0 × 1 0 × 4 0 ×
不同类型的肿瘤有不同的生物学特性。如其发生侵袭和转移的时间、频率和程度等的不同。如肝癌细胞株 7721 发生侵袭和转移的时间早、其频率和程度均明显大于乳腺癌细胞株 22 。可见细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移、黏附于基质并呈克隆性生长形成多发性转移性肿瘤。有时可见大量细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移，呈克隆性生长并形成多个继发性肿瘤。 ( 图 5A-B)
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图 5
图 5A 乳腺癌细胞株， 5B 肝癌细胞株 7721 。不同类型的肿瘤有不同的生物学特性。肝癌细胞株 7721 发生侵袭和转移的时间早、频率和程度均明显大于乳腺癌细胞株 22 。可见细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移、黏附于基质并呈克隆性生长形成多发性转移性肿瘤。放大倍数为 2 0 × 。
不同类型的肿瘤亦表现出明显不同程度的细胞凋亡。在我们所观察的肿瘤细胞模型中，卵巢癌发生细胞凋亡的程度最为显著。 ( 图 6A-B)
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图 6
图 6A 乳腺癌细胞株， 5B 卵巢癌细胞株。在我们所观察的肿瘤细胞模型中，卵巢癌 161 发生细胞凋亡的程度最为显著。放大倍数依次为 20×40× ......
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