淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术.pdf
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参见附件(73kb)。
淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
撰写 刘雪松
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行
融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技
术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克
隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备
单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
细胞融合前准备
细胞融合，选择杂交瘤
抗体的检测
杂交瘤的克隆化和冻存
单克隆抗体的大量生产
单克隆抗体的鉴定
影响因素、失败原因分析
一、细胞融合前准备
(一) 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要
在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原
为例的免疫方案:
初次免疫 1×107/0.5ml ip (腹腔内注射)
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
http://www.37c.com.cn/topic/006/technich/exp2.htm (1 of 11)2005-7-31 13:04:56淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
↓ 3周后
加强免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射)
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全
佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易
马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉
淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
│ (一般0.8～1ml 0.2ml/点)
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip
│ (ip剂量不宜超过0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip
│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
↓2～3周后
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶
性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高
机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
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(二) 饲养细胞
在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆
化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细
胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照
射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10周龄
↓
拉颈处死 浸泡于75%酒精，消毒3～5分钟
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入6～8ml培养液
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
放入10ml离心管，1200转/分离心5～6分钟
↓
用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37℃ CO2 孵箱培养
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一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×10 6 腹腔巨噬细胞，若用小鼠
胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×10 6 /ml，小鼠脾细胞为1×10 6 /ml，小鼠的成纤
维细胞(3T3)1×10 5/ml，均为100μl/孔。
(三) 骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细
胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓
度一般在10～20%，细胞的最大密度不得超106/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每
3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微
贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞
融合的关键。
(四) 免疫脾细胞
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强
免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较
高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不
锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏
体积的2倍，细胞数为2×108左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤
(一) 细胞融合流程
(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液
混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用
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不完全培养液洗1次 ......
淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
撰写 刘雪松
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行
融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技
术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克
隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备
单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
细胞融合前准备
细胞融合，选择杂交瘤
抗体的检测
杂交瘤的克隆化和冻存
单克隆抗体的大量生产
单克隆抗体的鉴定
影响因素、失败原因分析
一、细胞融合前准备
(一) 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要
在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原
为例的免疫方案:
初次免疫 1×107/0.5ml ip (腹腔内注射)
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
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↓ 3周后
加强免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射)
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全
佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易
马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉
淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
│ (一般0.8～1ml 0.2ml/点)
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip
│ (ip剂量不宜超过0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip
│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
↓2～3周后
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶
性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高
机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
http://www.37c.com.cn/topic/006/technich/exp2.htm (2 of 11)2005-7-31 13:04:56淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
(二) 饲养细胞
在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆
化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细
胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照
射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10周龄
↓
拉颈处死 浸泡于75%酒精，消毒3～5分钟
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入6～8ml培养液
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
放入10ml离心管，1200转/分离心5～6分钟
↓
用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37℃ CO2 孵箱培养
http://www.37c.com.cn/topic/006/technich/exp2.htm (3 of 11)2005-7-31 13:04:56淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×10 6 腹腔巨噬细胞，若用小鼠
胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×10 6 /ml，小鼠脾细胞为1×10 6 /ml，小鼠的成纤
维细胞(3T3)1×10 5/ml，均为100μl/孔。
(三) 骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细
胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓
度一般在10～20%，细胞的最大密度不得超106/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每
3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微
贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞
融合的关键。
(四) 免疫脾细胞
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强
免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较
高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不
锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏
体积的2倍，细胞数为2×108左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤
(一) 细胞融合流程
(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液
混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用
http://www.37c.com.cn/topic/006/technich/exp2.htm (4 of 11)2005-7-31 13:04:56淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
不完全培养液洗1次 ......
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