实验诊断学ppt课件:12.ppt
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参见附件(108KB)。
临床病原学检查
[目的要求]
掌握：感染性疾病的诊断和治疗原则
熟悉：感染性疾病病原学实验诊断及抗生素治疗的主要实验室监测方法
了解：病原学诊断的重要性，现代感染的类型和病原微生物的变迁
病原体检查的作用
1.感染性疾病的明确诊断
2.通过药敏试验指导临床合理用药
3.病原体监控和耐药性监控
第一节
标本采集、运送和检查方法
一.标本采集和运送
? 采集标本注意点：
1.标本容器必须无菌或清洁容器
2.选择最佳时间采集标本，在抗菌药物使用前
3.获取标本时，须严格无菌操作
4.标本采集后，应尽快送实验室
㈠血液
? 发热初期和高峰期采集
? 抗菌药物治疗前
? 成人每次10-20ml，婴幼儿1-2ml
? 标本不用抗凝剂
? 24小时内，可在不同部位采血3次
㈡尿液
? 无菌采集清洁中段尿
? 导尿或膀胱穿刺获得
㈢粪便
? 取含脓、血或粘液粪便置于清洁容器内
? 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子
? 对传染性腹泻须三次送检
㈣呼吸道标本
1.痰：⑴自然咳痰法
⑵气管镜采集法
2.鼻咽拭标本：同痰标本用清水漱口后采集
㈤脑脊液与其他无菌体液
? 脑脊液标本应立即保温送检
? 胸腹水等体液标本应抽取2-5ml送检
㈥泌尿生殖道标本
? 性传播疾病取尿道口分泌物、阴道宫颈口分泌物
? 生殖道疱疹常穿刺取疱疹液
㈦创伤、组织和脓肿标本
? 开放性脓肿：无菌棉拭采集脓液
? 封闭性脓肿：无菌注射器穿刺抽取
二.病原体检查的基本方法
1.临床标本细菌检验一般程序
一般程序
2.病原体诊断的基本方法
> 直接显微镜检测(microscopic examination)
⑴染色标本检查法：革兰染色和抗酸染色
⑵不染色标本检查法：悬滴法和压滴法
2.病原体诊断的基本方法
> 病原体分离培养(isolation and culture)和鉴定(identification)
? 培养基选择
? 生长条件：一般大气条件
厌氧条件
微需氧条件
2.病原体诊断的基本方法
> 鉴定技术：
? 生化鉴定
? 血清学鉴定
? 数码鉴定
? 自动化鉴定
2.病原体诊断的基本方法
> 血清学诊断：查特异性抗体--肥达氏试验
> 病原体特异性抗原检测
> 病原体核酸检测：查特异基因片段DNA/RNA--PCR、DNA探针杂交技术
第二节
细菌耐药性检查
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
1.定义：对敏感性不能预测的临床分离菌株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物和了解区域或医院内常见病原菌耐药性变迁，有助于临床经验性治疗选药。
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
2.常用敏感性试验方法
⑴手工试验:①K-B纸片琼脂扩散法
结果表示:S-Susceptible
I-Intermediate
R-Resistant
②稀释法(MIC)
③Etest
④联合药敏试验
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
⑵自动化仪器Vitek，Microscan
⑶分子试验PCR直接检测mecA基因
⑷补充试验Nitrocefin
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
3.药敏试验结果与临床抗生素剂量关系
敏感(S)--一般剂量有效，推荐使用该抗生素用于临床治疗
中介(I)--大剂量有效，提示药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度
耐药(R)--大剂量无效,即常规用药剂量不能达到MIC
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
4.K-B纸片扩散试验的影响因素
琼脂厚度 与抑菌圈直径成反比
菌液浓度 与抑菌圈直径成反比
药敏试纸 含量-与抑菌圈直径成反比
保存温度-20℃，使用前室温平衡
30min后开启
湿度-密封容器，硅胶防潮
NCCLS标准培养种类(MH),厚度(4mm)
接种量(0.5MF)
选药标准,判读标准,质控标准
质控参考菌
金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC25922
铜绿假单胞菌ATCC26853
二.耐药机制及耐药性监测试验
1.耐药菌株：
耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)
耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)
耐万古霉素肠球菌(VRE)
质粒介导的超广谱?-内酰胺酶(ESBL)
多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌和不动杆菌
二.耐药机制及耐药性监测试验
2.耐药机制：
⑴药物渗入细菌减少
⑵产生灭火酶和钝化酶(?-内酰胺酶)
⑶细菌抗生素结合蛋白发生改变(PBP)
⑷代谢拮抗剂产生
二.耐药机制及耐药性监测试验
3.耐药性监测的特殊试验
⑴ ?-内酰胺酶检测
方法:头孢哨噻吩滤纸片法(nitrocefin)
意义: ?-内酰胺酶检测阳性,即对青霉素、氨卞西林等抗生素耐药
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑵超广谱?-内酰胺酶检测(ESBL)
定义：是水解青霉素，一代、二代和三代头孢菌及单酰胺类药物的酶，产生ESBL的细菌对上述抗生素耐药。
ESBL主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌中。
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑵超广谱?-内酰胺酶检测(ESBL)
方法：纸片扩散法和稀释法
意义：ESBL阳性预示对头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南等抗菌药物无效。
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑶琼脂筛选试验(agar screen test)
是以单一药物单一浓度检测细菌耐药性，如耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌检测。
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑷耐药基因检测
如MRSA中mecA基因检测
耐药性统计和分析
WHONET
建立本院、本地区和本国的细菌耐药性监测数据库和网络
第三节
医院感染检查(Nosocomial Infection)
医院感染检查
1.定义:病人入院时不存在,也不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。
医院感染检查
2.医院感染常见病原体(细菌)：革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌(MRSA)、厌氧菌和深部真菌等
医院感染检查
3.感染源: 外源或内源性病原体
外源性：其他住院患者、医务人员、探望者(多为条件致病菌)
内源性：患者自身皮肤、口腔、咽部和胃肠道固有的正常菌群等(免疫力低下患者)
医院感染检查
4.常见临床类型
下呼吸道感染
尿路感染
手术切口感染
胃肠道感染
血液感染
皮肤和组织感染
医院感染检查
5.感染途径：
? 接触传播
? 空气、飞沫传播
? 经注射或输液、输血传播
? 经口传播
医院感染检查
6.易感因素：
? 年龄：老年和婴幼儿
? 慢性疾病患者
? 基础疾病或医源性
? 烧伤或创伤产生坏死性组织
? 大量使用抗生素
? 接受侵袭性治疗操作
医院感染检查
7.医院感染常见病原菌监测
>尿液标本
病原菌--大肠埃希菌，变形杆菌，肺炎克雷伯氏菌，肠球菌，金黄色葡萄球菌，铜绿色假单胞菌
菌落计数>104/ml以上--尿路感染
医院感染检查
7. 医院感染常见病原菌监测
>痰(咽拭子)培养
病原菌--肺炎链球菌，肺炎克雷伯氏菌，大肠埃希菌，肠球菌，金黄色葡萄球菌，铜绿色假单胞菌等
半定量3+~4+为致病菌，1+~2+怀疑为污染菌
医院感染检查
7. 医院感染常见病原菌监测
>痰(咽拭子)培养
甲型溶血性链球菌是亚急性细菌性心内膜炎的主要致病菌
医院感染检查
7. 医院感染常见病原菌监测
> 粪培养
病原菌--金黄色葡萄球菌，伤寒及其他沙门氏菌，志贺氏菌属，致病性大肠埃希菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌，弯曲菌，念珠菌等
医院感染检查
7.医院感染常见病原菌监测
> 血培养：
病原菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等
单次血培养不易区分污染菌或感染菌。
两次培养均为同种皮肤正常菌群可认为感染菌。
医院感染检查
8.医院环境监测和消毒灭菌监测
> 空气培养：沉降法采样
> 物体表面监测：压印法
> 医务人员手部细菌监测
> 消毒灭菌效果监测
小结
复习思考题：
名词解释：微生物直接检测、微生物非培养检测、医院感染、药敏试验、耐药性、联合用药
问答题：
1.简述病原学诊断的基本原则
2.医院感染的定义、感染源、感染途径及易感因素
3.抗生素敏感试验的结果解释以及它们与临床抗生素剂量的关系
4. 各种临床标本中的主要致病菌及临床意义
5.什么是药敏试验及基本检验方法
? 参考书：
《现代病原学检验与临床实践》
上海科学技术文献出版社
倪语星 主编
临床病原学检查
[目的要求]
掌握：感染性疾病的诊断和治疗原则
熟悉：感染性疾病病原学实验诊断及抗生素治疗的主要实验室监测方法
了解：病原学诊断的重要性，现代感染的类型和病原微生物的变迁
病原体检查的作用
1.感染性疾病的明确诊断
2.通过药敏试验指导临床合理用药
3.病原体监控和耐药性监控
第一节
标本采集、运送和检查方法
一.标本采集和运送
? 采集标本注意点：
1.标本容器必须无菌或清洁容器
2.选择最佳时间采集标本，在抗菌药物使用前
3.获取标本时，须严格无菌操作
4.标本采集后，应尽快送实验室
㈠血液
? 发热初期和高峰期采集
? 抗菌药物治疗前
? 成人每次10-20ml，婴幼儿1-2ml
? 标本不用抗凝剂
? 24小时内，可在不同部位采血3次
㈡尿液
? 无菌采集清洁中段尿
? 导尿或膀胱穿刺获得
㈢粪便
? 取含脓、血或粘液粪便置于清洁容器内
? 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子
? 对传染性腹泻须三次送检
㈣呼吸道标本
1.痰：⑴自然咳痰法
⑵气管镜采集法
2.鼻咽拭标本：同痰标本用清水漱口后采集
㈤脑脊液与其他无菌体液
? 脑脊液标本应立即保温送检
? 胸腹水等体液标本应抽取2-5ml送检
㈥泌尿生殖道标本
? 性传播疾病取尿道口分泌物、阴道宫颈口分泌物
? 生殖道疱疹常穿刺取疱疹液
㈦创伤、组织和脓肿标本
? 开放性脓肿：无菌棉拭采集脓液
? 封闭性脓肿：无菌注射器穿刺抽取
二.病原体检查的基本方法
1.临床标本细菌检验一般程序
一般程序
2.病原体诊断的基本方法
> 直接显微镜检测(microscopic examination)
⑴染色标本检查法：革兰染色和抗酸染色
⑵不染色标本检查法：悬滴法和压滴法
2.病原体诊断的基本方法
> 病原体分离培养(isolation and culture)和鉴定(identification)
? 培养基选择
? 生长条件：一般大气条件
厌氧条件
微需氧条件
2.病原体诊断的基本方法
> 鉴定技术：
? 生化鉴定
? 血清学鉴定
? 数码鉴定
? 自动化鉴定
2.病原体诊断的基本方法
> 血清学诊断：查特异性抗体--肥达氏试验
> 病原体特异性抗原检测
> 病原体核酸检测：查特异基因片段DNA/RNA--PCR、DNA探针杂交技术
第二节
细菌耐药性检查
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
1.定义：对敏感性不能预测的临床分离菌株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物和了解区域或医院内常见病原菌耐药性变迁，有助于临床经验性治疗选药。
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
2.常用敏感性试验方法
⑴手工试验:①K-B纸片琼脂扩散法
结果表示:S-Susceptible
I-Intermediate
R-Resistant
②稀释法(MIC)
③Etest
④联合药敏试验
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
⑵自动化仪器Vitek，Microscan
⑶分子试验PCR直接检测mecA基因
⑷补充试验Nitrocefin
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
3.药敏试验结果与临床抗生素剂量关系
敏感(S)--一般剂量有效，推荐使用该抗生素用于临床治疗
中介(I)--大剂量有效，提示药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度
耐药(R)--大剂量无效,即常规用药剂量不能达到MIC
一.抗微生物药物敏感性试验(AST)
4.K-B纸片扩散试验的影响因素
琼脂厚度 与抑菌圈直径成反比
菌液浓度 与抑菌圈直径成反比
药敏试纸 含量-与抑菌圈直径成反比
保存温度-20℃，使用前室温平衡
30min后开启
湿度-密封容器，硅胶防潮
NCCLS标准培养种类(MH),厚度(4mm)
接种量(0.5MF)
选药标准,判读标准,质控标准
质控参考菌
金黄色葡萄球菌ATCC25923
大肠埃希菌ATCC25922
铜绿假单胞菌ATCC26853
二.耐药机制及耐药性监测试验
1.耐药菌株：
耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)
耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)
耐万古霉素肠球菌(VRE)
质粒介导的超广谱?-内酰胺酶(ESBL)
多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌和不动杆菌
二.耐药机制及耐药性监测试验
2.耐药机制：
⑴药物渗入细菌减少
⑵产生灭火酶和钝化酶(?-内酰胺酶)
⑶细菌抗生素结合蛋白发生改变(PBP)
⑷代谢拮抗剂产生
二.耐药机制及耐药性监测试验
3.耐药性监测的特殊试验
⑴ ?-内酰胺酶检测
方法:头孢哨噻吩滤纸片法(nitrocefin)
意义: ?-内酰胺酶检测阳性,即对青霉素、氨卞西林等抗生素耐药
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑵超广谱?-内酰胺酶检测(ESBL)
定义：是水解青霉素，一代、二代和三代头孢菌及单酰胺类药物的酶，产生ESBL的细菌对上述抗生素耐药。
ESBL主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌中。
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑵超广谱?-内酰胺酶检测(ESBL)
方法：纸片扩散法和稀释法
意义：ESBL阳性预示对头孢泊肟、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南等抗菌药物无效。
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑶琼脂筛选试验(agar screen test)
是以单一药物单一浓度检测细菌耐药性，如耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌检测。
二.耐药机制及耐药性监测试验
⑷耐药基因检测
如MRSA中mecA基因检测
耐药性统计和分析
WHONET
建立本院、本地区和本国的细菌耐药性监测数据库和网络
第三节
医院感染检查(Nosocomial Infection)
医院感染检查
1.定义:病人入院时不存在,也不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。
医院感染检查
2.医院感染常见病原体(细菌)：革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌(MRSA)、厌氧菌和深部真菌等
医院感染检查
3.感染源: 外源或内源性病原体
外源性：其他住院患者、医务人员、探望者(多为条件致病菌)
内源性：患者自身皮肤、口腔、咽部和胃肠道固有的正常菌群等(免疫力低下患者)
医院感染检查
4.常见临床类型
下呼吸道感染
尿路感染
手术切口感染
胃肠道感染
血液感染
皮肤和组织感染
医院感染检查
5.感染途径：
? 接触传播
? 空气、飞沫传播
? 经注射或输液、输血传播
? 经口传播
医院感染检查
6.易感因素：
? 年龄：老年和婴幼儿
? 慢性疾病患者
? 基础疾病或医源性
? 烧伤或创伤产生坏死性组织
? 大量使用抗生素
? 接受侵袭性治疗操作
医院感染检查
7.医院感染常见病原菌监测
>尿液标本
病原菌--大肠埃希菌，变形杆菌，肺炎克雷伯氏菌，肠球菌，金黄色葡萄球菌，铜绿色假单胞菌
菌落计数>104/ml以上--尿路感染
医院感染检查
7. 医院感染常见病原菌监测
>痰(咽拭子)培养
病原菌--肺炎链球菌，肺炎克雷伯氏菌，大肠埃希菌，肠球菌，金黄色葡萄球菌，铜绿色假单胞菌等
半定量3+~4+为致病菌，1+~2+怀疑为污染菌
医院感染检查
7. 医院感染常见病原菌监测
>痰(咽拭子)培养
甲型溶血性链球菌是亚急性细菌性心内膜炎的主要致病菌
医院感染检查
7. 医院感染常见病原菌监测
> 粪培养
病原菌--金黄色葡萄球菌，伤寒及其他沙门氏菌，志贺氏菌属，致病性大肠埃希菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌，弯曲菌，念珠菌等
医院感染检查
7.医院感染常见病原菌监测
> 血培养：
病原菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等
单次血培养不易区分污染菌或感染菌。
两次培养均为同种皮肤正常菌群可认为感染菌。
医院感染检查
8.医院环境监测和消毒灭菌监测
> 空气培养：沉降法采样
> 物体表面监测：压印法
> 医务人员手部细菌监测
> 消毒灭菌效果监测
小结
复习思考题：
名词解释：微生物直接检测、微生物非培养检测、医院感染、药敏试验、耐药性、联合用药
问答题：
1.简述病原学诊断的基本原则
2.医院感染的定义、感染源、感染途径及易感因素
3.抗生素敏感试验的结果解释以及它们与临床抗生素剂量的关系
4. 各种临床标本中的主要致病菌及临床意义
5.什么是药敏试验及基本检验方法
? 参考书：
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上海科学技术文献出版社
倪语星 主编
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