分子生物学方法在真菌感染诊断中的应用
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参见附件(11kb)。
真菌感染的诊断以往主要以形态学为依据，即通过培养或者直接镜检阳性为指标。近年来，随着免疫学、生物化学及分子生物学技术的发展，各种检测手段不断被应用于真菌病诊断及菌种鉴定中；分子生物学技术的应用更使得从分子水平上诊断真菌感染成为可能，并可使感染菌种的确立与快速诊断一步完成。
利用分子生物学技术从分子水平上诊断真菌感染具有以下特点：⑴特异性好、敏感性高；⑵快速、便捷，并能迅速鉴定至种，为选择合适的治疗方式提供依据。
一、多聚酶链式反应(PCR)
PCR方法的应用，使得侵袭性真菌感染的早期诊断成为可能，为这些病人的治疗提供了理论依据。
PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促方法，可用于扩增位于两段已知序列之间的DNA，其原理不必赘述。而改进的PCR技术如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、荧光PCR技术等则又在较大程度上增加了该技术的敏感性与特异性。近年来，PCR方法已渗透至临床检测的各个领域，并逐渐应用于真菌病的诊断中。
确定真菌感染可用常规PCR，引物设计自真菌的保守序列；若判定感染真菌的种类则需应用属种等的特异性引物。前者多取自核糖体蛋白基因(rDNA)及其转录间隔区(ITS)，比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9、ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等；后者则根据属种间高变区或者特异基因设计而成，直接鉴定至种或群，这样既满足了临床菌种鉴定的需要，还可用于流行病学调查。
早在数年前就有学者将PCR方法用于菌种的鉴定，研究最多的为念珠菌属和曲霉属，如Jaeger 在18S RNA 基因部位设计了三条种特异性引物，应用巢式PCR对眼睛分泌物进行了检测，在3例培养阳性的标本中均为阳性，然而，在1例培养阴性的标本中，PCR检测为阳性，为早期用药提供了时机。该方法可以检测到50 to 100 fg的水平，其敏感性远较传统的真菌培养方法敏感。
Aspergillus flavus, A. fumigatus, 和 A.terreus是侵袭性曲霉病的三种主要致病菌，其侵袭力、病死率及对抗真菌药物的敏感性均存在较大差异，从种的水平上进行鉴别较为困难。美国作者Henry应用特异引物对曲霉的这三种主要致病菌种进行了鉴定，在对11份临床标本进行的双盲试验中，PCR方法与形态学方法取得了较好的一致性。Zhao等应用巢氏PCR技术将曲霉的主要致病菌种烟曲霉进行了扩增，并对其特异性及敏感性进行了试验，取得了较大的成功；李等对暗色丝孢霉病的主要致病菌种皮炎外瓶霉进行了研究，种特异引物对这一亲神经性真菌进行了成功地扩增。另外，在临床实践中，经常可以发现有些镜检阳性的感染经多次培养仍不能获得阳性结果，应用PCR等分子生物学方法不仅可以协助诊断，还可获得流行病学资料。
二、分子杂交(molecular nucleic acid hybridization)
本节中您将看到分子杂交技术的原理、常用的一些方法以及这些方法各自应用的特点。
1.原理
分子杂交技术是近年来用于真菌检测的方法之一。其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下(适宜的温度和离子浓度)发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针(probe)，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。杂交的双方是待测核酸序列及探针(或者为抗原及抗体)。在临床真菌检验中，待测核酸序列可以为真菌基因组DNA和细胞总RNA，将核酸从细胞中分离纯化后或者经PCR获得的基因片段可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可以直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。
2. 种类
⑴ Southern blot
DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。主要用于真菌病的诊断和菌种的分型、还可用于监测耐药菌株、流行病学分型等。近年来，这方面的研究逐渐增多，如Gabal等曾用黄曲霉特异性探针从混有各种曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Pencillium spp.)、酵母(yeasts)、细菌、病毒的呼吸道分泌物中成功地检测到了黄曲霉；再如Muller等在对一HIV阳性家庭成员所患的念珠菌进行研究时发现，从母女三人分离的三株白念珠菌基因型完全相同。有作者曾用Ca3探针对院内感染真菌进行了研究，发现90%以上的病人分离菌株和医务人员分离株具有相同的基因型。
⑵ Northern blot
Northern blot是经典的RNA分析法(用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析)，提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。Lopez-Ribot等在应用Northern blot对口咽部念珠菌病患者进行研究时发现，分离自同一病人的菌株对羊毛甾醇去甲基化酶的表达量有所不同，因而推断真菌在感染过程中可以通过不同的机制发展成为耐药菌。
⑶ Western blot
这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。常用于检测组织间真菌蛋白代谢产物差异、抗原决定簇、血清中的抗体等。在系统性真菌感染的早期，Western blot要较一般的免疫沉淀、补体结合等方法敏感得多。有作者在对早期隐性组织胞浆菌感染进行检查时发现，前者的阳性率可提高到90%以上，而后者只有45%。Kopecek在研究须癣毛癣菌时应用Western blot方法对不同温度及CO2分压时菌丝中蛋白含量进行了测定，发现不同条件时蛋白分子表达有较大差异，认为在须癣毛癣菌，部分热休克蛋白可能参与了致病作用。
⑷ 原位杂交(in sito nucleic acid hybridization)
应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。由于该方法特异性高，并可以准确定位，近年来，已较多地应用于各种真菌病的活体组织检查中。特别是当应用种特异性引物时，可以将病原菌一步鉴定至种。目前，越来越多的特异性探针正在逐渐问世，给临床真菌检测带来了极大的方便。美国学者Zimmerman在研究侵袭性肺曲霉病时发现，应用rRNA探针，从细胞学角度检测可在1h内出结果，而培养方法则至少要1周。在4例原位杂交阳性的临床标本中，三份在1周后曲霉培养阳性；北京大学真菌和真菌病中心在对念珠菌病研究时，也显示该方法较其他病理染色方法要敏感得多。目前，该中心正在致力于曲霉、暗色真菌等的研究，有望在不远的将来，能将该项技术应用于临床检验中。
三、随机扩增多态性分析DNA(RAPD) ......
真菌感染的诊断以往主要以形态学为依据，即通过培养或者直接镜检阳性为指标。近年来，随着免疫学、生物化学及分子生物学技术的发展，各种检测手段不断被应用于真菌病诊断及菌种鉴定中；分子生物学技术的应用更使得从分子水平上诊断真菌感染成为可能，并可使感染菌种的确立与快速诊断一步完成。
利用分子生物学技术从分子水平上诊断真菌感染具有以下特点：⑴特异性好、敏感性高；⑵快速、便捷，并能迅速鉴定至种，为选择合适的治疗方式提供依据。
一、多聚酶链式反应(PCR)
PCR方法的应用，使得侵袭性真菌感染的早期诊断成为可能，为这些病人的治疗提供了理论依据。
PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促方法，可用于扩增位于两段已知序列之间的DNA，其原理不必赘述。而改进的PCR技术如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、荧光PCR技术等则又在较大程度上增加了该技术的敏感性与特异性。近年来，PCR方法已渗透至临床检测的各个领域，并逐渐应用于真菌病的诊断中。
确定真菌感染可用常规PCR，引物设计自真菌的保守序列；若判定感染真菌的种类则需应用属种等的特异性引物。前者多取自核糖体蛋白基因(rDNA)及其转录间隔区(ITS)，比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9、ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等；后者则根据属种间高变区或者特异基因设计而成，直接鉴定至种或群，这样既满足了临床菌种鉴定的需要，还可用于流行病学调查。
早在数年前就有学者将PCR方法用于菌种的鉴定，研究最多的为念珠菌属和曲霉属，如Jaeger 在18S RNA 基因部位设计了三条种特异性引物，应用巢式PCR对眼睛分泌物进行了检测，在3例培养阳性的标本中均为阳性，然而，在1例培养阴性的标本中，PCR检测为阳性，为早期用药提供了时机。该方法可以检测到50 to 100 fg的水平，其敏感性远较传统的真菌培养方法敏感。
Aspergillus flavus, A. fumigatus, 和 A.terreus是侵袭性曲霉病的三种主要致病菌，其侵袭力、病死率及对抗真菌药物的敏感性均存在较大差异，从种的水平上进行鉴别较为困难。美国作者Henry应用特异引物对曲霉的这三种主要致病菌种进行了鉴定，在对11份临床标本进行的双盲试验中，PCR方法与形态学方法取得了较好的一致性。Zhao等应用巢氏PCR技术将曲霉的主要致病菌种烟曲霉进行了扩增，并对其特异性及敏感性进行了试验，取得了较大的成功；李等对暗色丝孢霉病的主要致病菌种皮炎外瓶霉进行了研究，种特异引物对这一亲神经性真菌进行了成功地扩增。另外，在临床实践中，经常可以发现有些镜检阳性的感染经多次培养仍不能获得阳性结果，应用PCR等分子生物学方法不仅可以协助诊断，还可获得流行病学资料。
二、分子杂交(molecular nucleic acid hybridization)
本节中您将看到分子杂交技术的原理、常用的一些方法以及这些方法各自应用的特点。
1.原理
分子杂交技术是近年来用于真菌检测的方法之一。其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下(适宜的温度和离子浓度)发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针(probe)，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。杂交的双方是待测核酸序列及探针(或者为抗原及抗体)。在临床真菌检验中，待测核酸序列可以为真菌基因组DNA和细胞总RNA，将核酸从细胞中分离纯化后或者经PCR获得的基因片段可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可以直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。
2. 种类
⑴ Southern blot
DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。主要用于真菌病的诊断和菌种的分型、还可用于监测耐药菌株、流行病学分型等。近年来，这方面的研究逐渐增多，如Gabal等曾用黄曲霉特异性探针从混有各种曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Pencillium spp.)、酵母(yeasts)、细菌、病毒的呼吸道分泌物中成功地检测到了黄曲霉；再如Muller等在对一HIV阳性家庭成员所患的念珠菌进行研究时发现，从母女三人分离的三株白念珠菌基因型完全相同。有作者曾用Ca3探针对院内感染真菌进行了研究，发现90%以上的病人分离菌株和医务人员分离株具有相同的基因型。
⑵ Northern blot
Northern blot是经典的RNA分析法(用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析)，提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。Lopez-Ribot等在应用Northern blot对口咽部念珠菌病患者进行研究时发现，分离自同一病人的菌株对羊毛甾醇去甲基化酶的表达量有所不同，因而推断真菌在感染过程中可以通过不同的机制发展成为耐药菌。
⑶ Western blot
这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。常用于检测组织间真菌蛋白代谢产物差异、抗原决定簇、血清中的抗体等。在系统性真菌感染的早期，Western blot要较一般的免疫沉淀、补体结合等方法敏感得多。有作者在对早期隐性组织胞浆菌感染进行检查时发现，前者的阳性率可提高到90%以上，而后者只有45%。Kopecek在研究须癣毛癣菌时应用Western blot方法对不同温度及CO2分压时菌丝中蛋白含量进行了测定，发现不同条件时蛋白分子表达有较大差异，认为在须癣毛癣菌，部分热休克蛋白可能参与了致病作用。
⑷ 原位杂交(in sito nucleic acid hybridization)
应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。由于该方法特异性高，并可以准确定位，近年来，已较多地应用于各种真菌病的活体组织检查中。特别是当应用种特异性引物时，可以将病原菌一步鉴定至种。目前，越来越多的特异性探针正在逐渐问世，给临床真菌检测带来了极大的方便。美国学者Zimmerman在研究侵袭性肺曲霉病时发现，应用rRNA探针，从细胞学角度检测可在1h内出结果，而培养方法则至少要1周。在4例原位杂交阳性的临床标本中，三份在1周后曲霉培养阳性；北京大学真菌和真菌病中心在对念珠菌病研究时，也显示该方法较其他病理染色方法要敏感得多。目前，该中心正在致力于曲霉、暗色真菌等的研究，有望在不远的将来，能将该项技术应用于临床检验中。
三、随机扩增多态性分析DNA(RAPD) ......
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