分子生物学方法在真菌感染诊断中的应用
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真菌感染的诊断以往主要以形态学为依据，即通过培养或者直接镜检阳性为指标。近年来，随着免疫学、生物化学及分子生物学技术的发展，各种检测手段不断被应用于真菌病诊断及菌种鉴定中；分子生物学技术的应用更使得从分子水平上诊断真菌感染成为可能，并可使感染菌种的确立与快速诊断一步完成。
利用分子生物学技术从分子水平上诊断真菌感染具有以下特点：⑴特异性好、敏感性高；⑵快速、便捷，并能迅速鉴定至种，为选择合适的治疗方式提供依据。
一、多聚酶链式反应(PCR)
PCR方法的应用，使得侵袭性真菌感染的早期诊断成为可能，为这些病人的治疗提供了理论依据。
PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促方法，可用于扩增位于两段已知序列之间的DNA，其原理不必赘述。而改进的PCR技术如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、荧光PCR技术等则又在较大程度上增加了该技术的敏感性与特异性。近年来，PCR方法已渗透至临床检测的各个领域，并逐渐应用于真菌病的诊断中。
确定真菌感染可用常规PCR，引物设计自真菌的保守序列；若判定感染真菌的种类则需应用属种等的特异性引物。前者多取自核糖体蛋白基因(rDNA)及其转录间隔区(ITS)，比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9、ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等；后者则根据属种间高变区或者特异基因设计而成，直接鉴定至种或群，这样既满足了临床菌种鉴定的需要，还可用于流行病学调查。
早在数年前就有学者将PCR方法用于菌种的鉴定，研究最多的为念珠菌属和曲霉属，如Jaeger 在18S RNA 基因部位设计了三条种特异性引物，应用巢式PCR对眼睛分泌物进行了检测，在3例培养阳性的标本中均为阳性，然而，在1例培养阴性的标本中，PCR检测为阳性，为早期用药提供了时机。该方法可以检测到50 to 100 fg的水平，其敏感性远较传统的真菌培养方法敏感。
Aspergillus flavus, A. fumigatus, 和 A.terreus是侵袭性曲霉病的三种主要致病菌，其侵袭力、病死率及对抗真菌药物的敏感性均存在较大差异，从种的水平上进行鉴别较为困难。美国作者Henry应用特异引物对曲霉的这三种主要致病菌种进行了鉴定，在对11份临床标本进行的双盲试验中，PCR方法与形态学方法取得了较好的一致性。Zhao等应用巢氏PCR技术将曲霉的主要致病菌种烟曲霉进行了扩增，并对其特异性及敏感性进行了试验，取得了较大的成功；李等对暗色丝孢霉病的主要致病菌种皮炎外瓶霉进行了研究，种特异引物对这一亲神经性真菌进行了成功地扩增。另外，在临床实践中，经常可以发现有些镜检阳性的感染经多次培养仍不能获得阳性结果，应用PCR等分子生物学方法不仅可以协助诊断，还可获得流行病学资料。
二、分子杂交(molecular nucleic acid hybridization)
本节中您将看到分子杂交技术的原理、常用的一些方法以及这些方法各自应用的特点。
1.原理
分子杂交技术是近年来用于真菌检测的方法之一。其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下(适宜的温度和离子浓度)发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针(probe)，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。杂交的双方是待测核酸序列及探针(或者为抗原及抗体)。在临床真菌检验中，待测核酸序列可以为真菌基因组DNA和细胞总RNA，将核酸从细胞中分离纯化后或者经PCR获得的基因片段可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可以直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。
2. 种类
⑴ Southern blot
DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。主要用于真菌病的诊断和菌种的分型、还可用于监测耐药菌株、流行病学分型等。近年来，这方面的研究逐渐增多，如Gabal等曾用黄曲霉特异性探针从混有各种曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Pencillium spp.)、酵母(yeasts)、细菌、病毒的呼吸道分泌物中成功地检测到了黄曲霉；再如Muller等在对一HIV阳性家庭成员所患的念珠菌进行研究时发现，从母女三人分离的三株白念珠菌基因型完全相同。有作者曾用Ca3探针对院内感染真菌进行了研究，发现90%以上的病人分离菌株和医务人员分离株具有相同的基因型。
⑵ Northern blot
Northern blot是经典的RNA分析法(用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析)，提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。Lopez-Ribot等在应用Northern blot对口咽部念珠菌病患者进行研究时发现，分离自同一病人的菌株对羊毛甾醇去甲基化酶的表达量有所不同，因而推断真菌在感染过程中可以通过不同的机制发展成为耐药菌。
⑶ Western blot
这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。常用于检测组织间真菌蛋白代谢产物差异、抗原决定簇、血清中的抗体等。在系统性真菌感染的早期，Western blot要较一般的免疫沉淀、补体结合等方法敏感得多。有作者在对早期隐性组织胞浆菌感染进行检查时发现，前者的阳性率可提高到90%以上，而后者只有45%。Kopecek在研究须癣毛癣菌时应用Western blot方法对不同温度及CO2分压时菌丝中蛋白含量进行了测定，发现不同条件时蛋白分子表达有较大差异，认为在须癣毛癣菌，部分热休克蛋白可能参与了致病作用。
⑷ 原位杂交(in sito nucleic acid hybridization)
应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。由于该方法特异性高，并可以准确定位，近年来，已较多地应用于各种真菌病的活体组织检查中。特别是当应用种特异性引物时，可以将病原菌一步鉴定至种。目前，越来越多的特异性探针正在逐渐问世，给临床真菌检测带来了极大的方便。美国学者Zimmerman在研究侵袭性肺曲霉病时发现，应用rRNA探针，从细胞学角度检测可在1h内出结果，而培养方法则至少要1周。在4例原位杂交阳性的临床标本中，三份在1周后曲霉培养阳性；北京大学真菌和真菌病中心在对念珠菌病研究时，也显示该方法较其他病理染色方法要敏感得多。目前，该中心正在致力于曲霉、暗色真菌等的研究，有望在不远的将来，能将该项技术应用于临床检验中。
三、随机扩增多态性分析DNA(RAPD)
1.原理
应用随机合成的单个寡核苷酸(8-12bp，多为10bp)作为引物，经PCR将模板DNA进行扩增，采用低退火温度使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合而形成扩增产物。扩增循环次数要求较多，一般为35-45个。特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型。
2.应用
应用RAPD方法对致病菌种进行分型及流行病学研究的较多，几乎囊括了所有的致病菌种，如外瓶霉、皮肤癣菌、念珠菌、曲霉等。研究中发现，致病菌种的分型与分离部位、致病性以及自然栖息地等因素具有一定的关联性。在一肾移植医院的侵袭性肺曲霉病(invasive aspergillosis, IA)暴发流行期间，Aufaure-Brown等应用RAPD方法对分离出的烟曲霉进行了检测，结果表明这两个患者由不同的菌株所感染，而且这两个分离株与该医院环境中所分离到的11个菌株均不相同；在另一IA暴发流行调查中，发现三例患者在各自的感染的一个月内分离出的烟曲霉菌株分别用三种方法显示具有相同的分型，因此这些患者很可能由同一个菌株所感染，然而当时从医院环境中分离出的菌株却与分离自患者的菌株不同，尽管广泛采样仍未发现相同的菌株。
四、限制性片段长度多态性分析(RFLP)
RFLP的方法对于鉴别真菌的类型具有较好的特异性及敏感性。而SSCP则可从基因突变的情况来判断致病或耐药株。
1.原理
RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA进行切割，然后进行凝胶电泳，依据片段大小不同将其分离开。由于不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，从而产生的DNA片断长度呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern 印迹杂交，应用该方法可以构建DNA 指纹图，这种方法特异性及敏感性均较高，但相对来说，操作较为烦琐。目前常用的是AP-RFLP(amplicon-RFLP)。对于真菌来说，根据多态性结果便可鉴别出不同的属、种或型。
2.应用
RFLP主要用于真菌的分类分型研究，也可用此对临床分离菌株进行鉴定，这方面的研究已有许多报到。DNA指纹图可以快速筛选致病株，曾有学者比较了5株引起医源性感染的白念珠菌菌株的EcoRⅠ指纹图谱，并以大量散发菌株作为对照，通过与其它方法比较发现，DNA指纹图多态性最高。北京大学皮肤科用该方法对暗色真菌外瓶霉进行了研究，将四种内切酶结果综合分析，可以得到种特异性图谱，给外瓶霉菌种鉴定提供了便捷的方法。国外学者已将该方法用于流行病学分析，如Girardin等曾对一组侵袭性肺曲霉(IA)病进行过研究，发现从所有IA患者分离的菌株均具有相同的基因型，并且还证实了其中一例IA患者的感染来源于病房，给院内感染问题敲响了警钟。
五、单链构象多态性分析(SSCP)
1.原理
单链构象多态性分析是指将PCR扩增得到的DNA片断进行变性，成为单链DNA，在一定的条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA进行分离。由于单链DNA的空间构象与分子内的碱基组成密切相关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速率不同，形成的带型即不相同，故能反映出单链DNA片段的多态性。
2.应用
SSCP技术常用于检测单个基因的突变，近年来已被应用于医学真菌的检测鉴定，该方法对于判定致病株与非致病株、耐药株与非耐药株，以及相近属种的鉴定等均具有一定的意义。该方法灵敏度较高，应用较为广泛。如在对致病真菌进行检测时，扩增自核糖体基因的197bp片段可以将曲霉鉴定到属的水平，并可一次性对烟曲霉和黄曲霉进行鉴别。
六、电泳核型(EK)分析
1.原理
电泳核型是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况，反映了染色体的大小、数目和形状的差异。它是通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)完成的，能分辨50kb至 10Mb范围内的DNA分子，基本满足酵母菌和丝状真菌的要求。对病原体而言，EK分析特别适用于低等真核微生物或原虫，它无需用RE消化和探针杂交，就可方便地从EK的差异区别不同的菌种。
2.应用
电泳核型技术已用于临床菌株鉴定，如刘等对23株新生隐球菌标准株和临床分离株的电泳核型，发现新生隐球菌染色体数目新型变种为10或12条，格特变种及上海变种为11条，大小在 0.4～2.1Mb之间。作者同时发现新生隐球菌的EK与其血清型有较好的相关性，同一血清型往往有相似的EK带型。Magee等分析了5株白念珠菌及5种其它念珠菌的核型，发现5株白念珠菌的染色体带型均彼此不同，并分离出9～10条染色体带，同时确定类星形念珠菌的染色体数为9，光滑念珠菌为10，而季也蒙念珠菌仅为6。EK分析带型清晰易辨、分辨力较强，电泳条件稳定时结果重复性好。但EK受电泳条件影响较大，影响不同实验室间的可比性，而且相同大小两条不同染色体往往因迁移率相近呈现为同一条带，影响分辨力。此外它需要昂贵的仪器，DNA的制备及PFGE过程也均较费时。
七、DNA序列分析(DNA sequencing)
DNA序列分析对于了解真菌的基因状况具有十分重要的意义；可用于设计探针及特异引物等，从可更有效地对真菌疾病进行诊断。
1. 原理
将待测DNA片段转变成一系列的放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可以直接读出DNA的序列。
2. 应用
在医学真菌中，DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。该方法可用于设计探针、特异引物等对真菌病进行诊断。序列的确定是对致病真菌的分类鉴别的重要手段。目前应用最多的为核糖体内转录间隔序列、几丁质合成霉等。
八、基因芯片技术
DNA芯片技术是用免疫荧光标记的待测样品与与有规律的固定在芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交，通过激光共聚焦荧光系统对芯片进行扫描，使用计算机进行荧光信号强度的比较和检测的技术。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。将不同属种真菌的特异性DNA标记后制成DNA芯片，将致病真菌DNA与DNA芯片杂交就可得到属种特异性图谱，通过这种图谱的比较和分析，就可得出致病菌的DNA信息，进而可对其进行鉴定。
分子生物学技术的发展已经渗透到真菌研究的各个领域，不但使真菌病早期诊断成为可能，而且可在确立真菌感染的同时迅速判断出致病菌的种类，指导治疗，提示预后。......（后略) ......
真菌感染的诊断以往主要以形态学为依据，即通过培养或者直接镜检阳性为指标。近年来，随着免疫学、生物化学及分子生物学技术的发展，各种检测手段不断被应用于真菌病诊断及菌种鉴定中；分子生物学技术的应用更使得从分子水平上诊断真菌感染成为可能，并可使感染菌种的确立与快速诊断一步完成。
利用分子生物学技术从分子水平上诊断真菌感染具有以下特点：⑴特异性好、敏感性高；⑵快速、便捷，并能迅速鉴定至种，为选择合适的治疗方式提供依据。
一、多聚酶链式反应(PCR)
PCR方法的应用，使得侵袭性真菌感染的早期诊断成为可能，为这些病人的治疗提供了理论依据。
PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促方法，可用于扩增位于两段已知序列之间的DNA，其原理不必赘述。而改进的PCR技术如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、荧光PCR技术等则又在较大程度上增加了该技术的敏感性与特异性。近年来，PCR方法已渗透至临床检测的各个领域，并逐渐应用于真菌病的诊断中。
确定真菌感染可用常规PCR，引物设计自真菌的保守序列；若判定感染真菌的种类则需应用属种等的特异性引物。前者多取自核糖体蛋白基因(rDNA)及其转录间隔区(ITS)，比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9、ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等；后者则根据属种间高变区或者特异基因设计而成，直接鉴定至种或群，这样既满足了临床菌种鉴定的需要，还可用于流行病学调查。
早在数年前就有学者将PCR方法用于菌种的鉴定，研究最多的为念珠菌属和曲霉属，如Jaeger 在18S RNA 基因部位设计了三条种特异性引物，应用巢式PCR对眼睛分泌物进行了检测，在3例培养阳性的标本中均为阳性，然而，在1例培养阴性的标本中，PCR检测为阳性，为早期用药提供了时机。该方法可以检测到50 to 100 fg的水平，其敏感性远较传统的真菌培养方法敏感。
Aspergillus flavus, A. fumigatus, 和 A.terreus是侵袭性曲霉病的三种主要致病菌，其侵袭力、病死率及对抗真菌药物的敏感性均存在较大差异，从种的水平上进行鉴别较为困难。美国作者Henry应用特异引物对曲霉的这三种主要致病菌种进行了鉴定，在对11份临床标本进行的双盲试验中，PCR方法与形态学方法取得了较好的一致性。Zhao等应用巢氏PCR技术将曲霉的主要致病菌种烟曲霉进行了扩增，并对其特异性及敏感性进行了试验，取得了较大的成功；李等对暗色丝孢霉病的主要致病菌种皮炎外瓶霉进行了研究，种特异引物对这一亲神经性真菌进行了成功地扩增。另外，在临床实践中，经常可以发现有些镜检阳性的感染经多次培养仍不能获得阳性结果，应用PCR等分子生物学方法不仅可以协助诊断，还可获得流行病学资料。
二、分子杂交(molecular nucleic acid hybridization)
本节中您将看到分子杂交技术的原理、常用的一些方法以及这些方法各自应用的特点。
1.原理
分子杂交技术是近年来用于真菌检测的方法之一。其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下(适宜的温度和离子浓度)发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针(probe)，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。杂交的双方是待测核酸序列及探针(或者为抗原及抗体)。在临床真菌检验中，待测核酸序列可以为真菌基因组DNA和细胞总RNA，将核酸从细胞中分离纯化后或者经PCR获得的基因片段可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可以直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。
2. 种类
⑴ Southern blot
DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。主要用于真菌病的诊断和菌种的分型、还可用于监测耐药菌株、流行病学分型等。近年来，这方面的研究逐渐增多，如Gabal等曾用黄曲霉特异性探针从混有各种曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Pencillium spp.)、酵母(yeasts)、细菌、病毒的呼吸道分泌物中成功地检测到了黄曲霉；再如Muller等在对一HIV阳性家庭成员所患的念珠菌进行研究时发现，从母女三人分离的三株白念珠菌基因型完全相同。有作者曾用Ca3探针对院内感染真菌进行了研究，发现90%以上的病人分离菌株和医务人员分离株具有相同的基因型。
⑵ Northern blot
Northern blot是经典的RNA分析法(用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析)，提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。Lopez-Ribot等在应用Northern blot对口咽部念珠菌病患者进行研究时发现，分离自同一病人的菌株对羊毛甾醇去甲基化酶的表达量有所不同，因而推断真菌在感染过程中可以通过不同的机制发展成为耐药菌。
⑶ Western blot
这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。常用于检测组织间真菌蛋白代谢产物差异、抗原决定簇、血清中的抗体等。在系统性真菌感染的早期，Western blot要较一般的免疫沉淀、补体结合等方法敏感得多。有作者在对早期隐性组织胞浆菌感染进行检查时发现，前者的阳性率可提高到90%以上，而后者只有45%。Kopecek在研究须癣毛癣菌时应用Western blot方法对不同温度及CO2分压时菌丝中蛋白含量进行了测定，发现不同条件时蛋白分子表达有较大差异，认为在须癣毛癣菌，部分热休克蛋白可能参与了致病作用。
⑷ 原位杂交(in sito nucleic acid hybridization)
应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。由于该方法特异性高，并可以准确定位，近年来，已较多地应用于各种真菌病的活体组织检查中。特别是当应用种特异性引物时，可以将病原菌一步鉴定至种。目前，越来越多的特异性探针正在逐渐问世，给临床真菌检测带来了极大的方便。美国学者Zimmerman在研究侵袭性肺曲霉病时发现，应用rRNA探针，从细胞学角度检测可在1h内出结果，而培养方法则至少要1周。在4例原位杂交阳性的临床标本中，三份在1周后曲霉培养阳性；北京大学真菌和真菌病中心在对念珠菌病研究时，也显示该方法较其他病理染色方法要敏感得多。目前，该中心正在致力于曲霉、暗色真菌等的研究，有望在不远的将来，能将该项技术应用于临床检验中。
三、随机扩增多态性分析DNA(RAPD)
1.原理
应用随机合成的单个寡核苷酸(8-12bp，多为10bp)作为引物，经PCR将模板DNA进行扩增，采用低退火温度使引物与模板DNA在可能有一或两个碱基错配的情况下结合而形成扩增产物。扩增循环次数要求较多，一般为35-45个。特征性带型的出现取决于引物和模板的DNA序列，依照带型可以进行菌种鉴定及分型。
2.应用
应用RAPD方法对致病菌种进行分型及流行病学研究的较多，几乎囊括了所有的致病菌种，如外瓶霉、皮肤癣菌、念珠菌、曲霉等。研究中发现，致病菌种的分型与分离部位、致病性以及自然栖息地等因素具有一定的关联性。在一肾移植医院的侵袭性肺曲霉病(invasive aspergillosis, IA)暴发流行期间，Aufaure-Brown等应用RAPD方法对分离出的烟曲霉进行了检测，结果表明这两个患者由不同的菌株所感染，而且这两个分离株与该医院环境中所分离到的11个菌株均不相同；在另一IA暴发流行调查中，发现三例患者在各自的感染的一个月内分离出的烟曲霉菌株分别用三种方法显示具有相同的分型，因此这些患者很可能由同一个菌株所感染，然而当时从医院环境中分离出的菌株却与分离自患者的菌株不同，尽管广泛采样仍未发现相同的菌株。
四、限制性片段长度多态性分析(RFLP)
RFLP的方法对于鉴别真菌的类型具有较好的特异性及敏感性。而SSCP则可从基因突变的情况来判断致病或耐药株。
1.原理
RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA进行切割，然后进行凝胶电泳，依据片段大小不同将其分离开。由于不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，从而产生的DNA片断长度呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern 印迹杂交，应用该方法可以构建DNA 指纹图，这种方法特异性及敏感性均较高，但相对来说，操作较为烦琐。目前常用的是AP-RFLP(amplicon-RFLP)。对于真菌来说，根据多态性结果便可鉴别出不同的属、种或型。
2.应用
RFLP主要用于真菌的分类分型研究，也可用此对临床分离菌株进行鉴定，这方面的研究已有许多报到。DNA指纹图可以快速筛选致病株，曾有学者比较了5株引起医源性感染的白念珠菌菌株的EcoRⅠ指纹图谱，并以大量散发菌株作为对照，通过与其它方法比较发现，DNA指纹图多态性最高。北京大学皮肤科用该方法对暗色真菌外瓶霉进行了研究，将四种内切酶结果综合分析，可以得到种特异性图谱，给外瓶霉菌种鉴定提供了便捷的方法。国外学者已将该方法用于流行病学分析，如Girardin等曾对一组侵袭性肺曲霉(IA)病进行过研究，发现从所有IA患者分离的菌株均具有相同的基因型，并且还证实了其中一例IA患者的感染来源于病房，给院内感染问题敲响了警钟。
五、单链构象多态性分析(SSCP)
1.原理
单链构象多态性分析是指将PCR扩增得到的DNA片断进行变性，成为单链DNA，在一定的条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA进行分离。由于单链DNA的空间构象与分子内的碱基组成密切相关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速率不同，形成的带型即不相同，故能反映出单链DNA片段的多态性。
2.应用
SSCP技术常用于检测单个基因的突变，近年来已被应用于医学真菌的检测鉴定，该方法对于判定致病株与非致病株、耐药株与非耐药株，以及相近属种的鉴定等均具有一定的意义。该方法灵敏度较高，应用较为广泛。如在对致病真菌进行检测时，扩增自核糖体基因的197bp片段可以将曲霉鉴定到属的水平，并可一次性对烟曲霉和黄曲霉进行鉴别。
六、电泳核型(EK)分析
1.原理
电泳核型是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况，反映了染色体的大小、数目和形状的差异。它是通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)完成的，能分辨50kb至 10Mb范围内的DNA分子，基本满足酵母菌和丝状真菌的要求。对病原体而言，EK分析特别适用于低等真核微生物或原虫，它无需用RE消化和探针杂交，就可方便地从EK的差异区别不同的菌种。
2.应用
电泳核型技术已用于临床菌株鉴定，如刘等对23株新生隐球菌标准株和临床分离株的电泳核型，发现新生隐球菌染色体数目新型变种为10或12条，格特变种及上海变种为11条，大小在 0.4～2.1Mb之间。作者同时发现新生隐球菌的EK与其血清型有较好的相关性，同一血清型往往有相似的EK带型。Magee等分析了5株白念珠菌及5种其它念珠菌的核型，发现5株白念珠菌的染色体带型均彼此不同，并分离出9～10条染色体带，同时确定类星形念珠菌的染色体数为9，光滑念珠菌为10，而季也蒙念珠菌仅为6。EK分析带型清晰易辨、分辨力较强，电泳条件稳定时结果重复性好。但EK受电泳条件影响较大，影响不同实验室间的可比性，而且相同大小两条不同染色体往往因迁移率相近呈现为同一条带，影响分辨力。此外它需要昂贵的仪器，DNA的制备及PFGE过程也均较费时。
七、DNA序列分析(DNA sequencing)
DNA序列分析对于了解真菌的基因状况具有十分重要的意义；可用于设计探针及特异引物等，从可更有效地对真菌疾病进行诊断。
1. 原理
将待测DNA片段转变成一系列的放射性核素标记的单链寡核苷酸，并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同，成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中，寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中，从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可以直接读出DNA的序列。
2. 应用
在医学真菌中，DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。该方法可用于设计探针、特异引物等对真菌病进行诊断。序列的确定是对致病真菌的分类鉴别的重要手段。目前应用最多的为核糖体内转录间隔序列、几丁质合成霉等。
八、基因芯片技术
DNA芯片技术是用免疫荧光标记的待测样品与与有规律的固定在芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交，通过激光共聚焦荧光系统对芯片进行扫描，使用计算机进行荧光信号强度的比较和检测的技术。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。将不同属种真菌的特异性DNA标记后制成DNA芯片，将致病真菌DNA与DNA芯片杂交就可得到属种特异性图谱，通过这种图谱的比较和分析，就可得出致病菌的DNA信息，进而可对其进行鉴定。
分子生物学技术的发展已经渗透到真菌研究的各个领域，不但使真菌病早期诊断成为可能，而且可在确立真菌感染的同时迅速判断出致病菌的种类，指导治疗，提示预后。......（后略) ......
相关资料1：
- 医学微生物学(七年制).pdf
- 创世纪的第八天：20世纪分子生物学革命.pdf
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