核酸分离纯化.pdf
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核酸分离纯化 核酸分离纯化
朱国明DNA DNA提取及常见问题分析 提取及常见问题分析
RNA RNA提取及常见问题分析 提取及常见问题分析DNA是遗传信息的载体，是最重要的
生物信息分子，是分子生物学研究的主要
对象，因此DNA的提取是分子生物学实验
技术中最重要、最基本的操作 。
DNA DNA提取及常见问题分析 提取及常见问题分析? ? 染色体 染色体DNA DNA
? ? 非染色体 非染色体DNA DNA
DNA DNA提取方法： 提取方法：DNA DNA提取方法： 提取方法：
? 染色体DNA的提取
? CTAB法
? SDS法
? 其它方法DNA DNA提取方法： 提取方法：
? 非染色体DNA的提取
? 质粒DNA的提取
? 碱裂解法
? 煮沸法
? 线粒体、叶绿体DNA的提取
? 差速离心结合SDS裂解法基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法
? CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
? CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲
基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成
复合物。
? 该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的，通过有机溶
剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸
分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。? CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 Tris-HCl
(pH8.0)
EDTA
(pH8.0) NaCl CTAB β-巯基乙醇
终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V)
0.1%
(V/V)使用
前加入
? Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
? EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
? NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
? CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
? β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法? CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 组份 Tris Tris- -HCl HCl
( (pH8.0 pH8.0) )
EDTA EDTA
( (pH8.0 pH8.0) ) NaCl NaCl CTAB CTAB PVP40 PVP40
20 20 mM mM 5%(W/V) 5%(W/V)
β β- -巯基乙醇 巯基乙醇
终浓度 终浓度 100 100 mM mM 1.4M 1.4M 3%(W/V) 3%(W/V)
2% 2%( (V/V V/V) )使 使
用前加入 用前加入
? PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的
络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多
糖结合，有效去除多糖。
基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法? CTAB法流程图
植物材料 裂解液
上层溶液
液氮研磨 抽提
细胞裂解 干燥溶解
离心洗涤
酒精沉淀
DNA溶液
基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法? SDS法原理
基因组 基因组DNA DNA- -SDS SDS法 法
? SDS是一种阴离子去垢剂，在高温(55～65℃)条件下能裂解细
胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
? 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖
杂质沉淀，离心后除去沉淀；
? 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的
DNA。
组份 组份 Tris Tris- -HCl HCl
( (pH8.0 pH8.0) )
EDTA EDTA
( (pH 8.0 pH 8.0 ) ) NaCl NaCl SDS SDS
终浓度 终浓度 10 10 mM mM 20 20 mM mM 0.4M 0.4M 2% 2%
? SDS法DNA提取缓冲液? SDS法流程图 (以动物组织为例)
动物组织
细胞裂解
上层溶液 组织匀浆
抽提
干燥溶解
离心洗涤
酒精沉淀 DNA溶液
基因组 基因组DNA DNA- -SDS SDS法 法基因组 基因组DNA DNA- -其它方法 其它方法
? ? 物理方式 物理方式：玻璃珠法、 ：玻璃珠法、超声波法、研磨 超声波法、研磨
法、冻融法 法、冻融法
? ? 化学方式 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ：异硫氰酸胍法、碱裂解法
? ? 生物方式 生物方式：酶法 ：酶法
? 根据细胞裂解方式的不同有：基因组 基因组DNA DNA- -其它方法 其它方法
? ? 吸附材料结合法： 吸附材料结合法：
? 根据核酸分离纯化方式的不同有：
? 硅质材料
? 阴离子交换树脂
? 磁珠
高盐低pH值结合核酸 ......
朱国明DNA DNA提取及常见问题分析 提取及常见问题分析
RNA RNA提取及常见问题分析 提取及常见问题分析DNA是遗传信息的载体，是最重要的
生物信息分子，是分子生物学研究的主要
对象，因此DNA的提取是分子生物学实验
技术中最重要、最基本的操作 。
DNA DNA提取及常见问题分析 提取及常见问题分析? ? 染色体 染色体DNA DNA
? ? 非染色体 非染色体DNA DNA
DNA DNA提取方法： 提取方法：DNA DNA提取方法： 提取方法：
? 染色体DNA的提取
? CTAB法
? SDS法
? 其它方法DNA DNA提取方法： 提取方法：
? 非染色体DNA的提取
? 质粒DNA的提取
? 碱裂解法
? 煮沸法
? 线粒体、叶绿体DNA的提取
? 差速离心结合SDS裂解法基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法
? CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
? CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲
基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成
复合物。
? 该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的，通过有机溶
剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸
分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。? CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 Tris-HCl
(pH8.0)
EDTA
(pH8.0) NaCl CTAB β-巯基乙醇
终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V)
0.1%
(V/V)使用
前加入
? Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
? EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
? NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；
? CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
? β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法? CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 组份 Tris Tris- -HCl HCl
( (pH8.0 pH8.0) )
EDTA EDTA
( (pH8.0 pH8.0) ) NaCl NaCl CTAB CTAB PVP40 PVP40
20 20 mM mM 5%(W/V) 5%(W/V)
β β- -巯基乙醇 巯基乙醇
终浓度 终浓度 100 100 mM mM 1.4M 1.4M 3%(W/V) 3%(W/V)
2% 2%( (V/V V/V) )使 使
用前加入 用前加入
? PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的
络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多
糖结合，有效去除多糖。
基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法? CTAB法流程图
植物材料 裂解液
上层溶液
液氮研磨 抽提
细胞裂解 干燥溶解
离心洗涤
酒精沉淀
DNA溶液
基因组 基因组DNA DNA- - CTAB CTAB法 法? SDS法原理
基因组 基因组DNA DNA- -SDS SDS法 法
? SDS是一种阴离子去垢剂，在高温(55～65℃)条件下能裂解细
胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
? 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖
杂质沉淀，离心后除去沉淀；
? 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的
DNA。
组份 组份 Tris Tris- -HCl HCl
( (pH8.0 pH8.0) )
EDTA EDTA
( (pH 8.0 pH 8.0 ) ) NaCl NaCl SDS SDS
终浓度 终浓度 10 10 mM mM 20 20 mM mM 0.4M 0.4M 2% 2%
? SDS法DNA提取缓冲液? SDS法流程图 (以动物组织为例)
动物组织
细胞裂解
上层溶液 组织匀浆
抽提
干燥溶解
离心洗涤
酒精沉淀 DNA溶液
基因组 基因组DNA DNA- -SDS SDS法 法基因组 基因组DNA DNA- -其它方法 其它方法
? ? 物理方式 物理方式：玻璃珠法、 ：玻璃珠法、超声波法、研磨 超声波法、研磨
法、冻融法 法、冻融法
? ? 化学方式 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ：异硫氰酸胍法、碱裂解法
? ? 生物方式 生物方式：酶法 ：酶法
? 根据细胞裂解方式的不同有：基因组 基因组DNA DNA- -其它方法 其它方法
? ? 吸附材料结合法： 吸附材料结合法：
? 根据核酸分离纯化方式的不同有：
? 硅质材料
? 阴离子交换树脂
? 磁珠
高盐低pH值结合核酸 ......
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