基因工程原理和技术.pdf
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2020年1月14日
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基因工程原理和技术，这是一本关于基因相关的生物技术教材类书籍，在书中为同学们详细的介绍了基因的原理和技术等，让你能够更加了解基因工程!
基因工程原理和技术内容提要
《基因工程原理和技术/面向21世纪高等院校规划教材·生物技术与生物工程系列》系统阐述了基因工程的基本原理与技术，并将生命科学的最新研究成果融入其中，将基因克隆的技术与原理紧密结合，适应生命科学的飞跃发展与高等院校相关课程教学的需要。
《基因工程原理和技术/面向21世纪高等院校规划教材·生物技术与生物工程系列》共分为12章，第1章介绍基因工程的发展概况，使学生全面了解这一门学科；第2章介绍基因工程操作中涉及的工具酶；第3章介绍基因工程载体；第4章阐述基因工程基本操作技术；第5章阐述聚合酶链反应技术；第6章介绍基因文库构建技术；第7章介绍重组DNA的连接和筛选鉴定方法；第8章介绍大肠杆菌基因工程；第9章介绍酵母菌和丝状真菌基因工程；第10章介绍植物基因工程；第11章介绍动物基因工程；第12章介绍基因工程的专利以及安全性。
《基因工程原理和技术/面向21世纪高等院校规划教材·生物技术与生物工程系列》理论与实际相结合，在内容安排上注重科学性、系统性、条理性、实用性，可以作为高等院校生物工程、生物技术、应用生物技术等专业的教材，也可作为基因工程科研人员的参考书。
基因工程原理和技术部分目录
第1章 基因工程的定义
第2章 基因工程研究的主要内容
第3章 限制性核酸内切酶
第4章 DNA连接酶
第5章 末端脱氧核苷酸转移酶
第6章 质粒载体
第7章 入噬菌体载体
第8章 单链DNA噬菌体载体
第9章 人工染色体
第10章 核酸的提取与纯化
第11章 核酸的检测与保存
第12章 核酸的凝胶电泳
第13章 分子杂交技术
第14章 核酸的序列分析技术
第15章 核酸和蛋白互作研究技术
第16章 通路克隆一Gateway技术
第17章 PCR技术的原理
第18章 聚合酶链反应技术类型
第19章 荧光定量PCR技术
第20章 基因组DNA文库的构建
基因具有的六大特点
1、不同基因具有相同的物质基础。原则上，所有生物的DNA都是可以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物的DNA结构都是一样的。有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒RNA可以通过反转录产生cDNA，并不影响不同基因的重组互换。
2、基因是可以切割的。基因在染色体上的存在形式是直线排列。大多数基因彼此之间存在着间隔，少数基因是重叠排列的。
3、基因是可以转移的。生物体内有的基因是可以在染色体上移动的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。基因在转移的过程中就完成了基因间的重组。
4、多肽与基因之间存在对应关系。现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。
5、遗传密码是通用的。一系列的三联密码子(除极少数外)同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。
6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。
基因工程原理和技术截图
第一卷
第1章 基因工程的定义
第2章 基因工程研究的主要内容
第二卷
第3章 限制性核酸内切酶
第4章 DNA连接酶
第5章 末端脱氧核苷酸转移酶
第三卷
第6章 质粒载体
第7章 λ噬菌体载体
第8章 单链DNA噬菌体载体
第9章 人工染色体
第四卷
第10章 核酸的提取与纯化
第11章 核酸的检测与保存
第12章 核酸的凝胶电泳
第13章 分子杂交技术第14章 核酸的序列分析技术
第15章 核酸和蛋白互作研究技术
第16章 通路克隆—Gateway技术
第五卷
第17章 PCR技术的原理
第18章 聚合酶链反应技术类型
第19章 荧光定量PCR技术
第六卷
第20章 基因组DNA文库的构建
第21章 cDNA文库的构建
第七卷
第22章 目的基因与质粒载体的连接
第23章 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
第24章 物理检测法
第25章 免疫化学检测法
第八卷
第26章 外源基因正确表达的基本条件第27章 常用的大肠杆菌表达载体
第28章 外源蛋白质表达部位
第29章 提高外源基因表达效率的方法
第九卷
第30章 酵母菌的基因工程
第31章 丝状真菌的基因工程
第十卷
第32章 目的基因的分离和鉴定
第33章 植物表达载体——启动子
第34章 目的基因的转化方法
第35章 转基因植物中外源基因的沉默
第36章 转基因植物的安全性和对策
第十一卷
第37章 生产转基因动物的关键技术
第38章 转基因动物的检测
第39章 转基因动物技术存在的问题
第40章 转基因动物乳腺生物反应器第十二卷
第41章 基因工程实验室安全性的基本要求
第42章 现代生物技术专利第1章 基因工程的定义
人们对基因的认识经历了长时间的发展过程，而且随着生命科学的
发展，基因的概念还在不断深化。
19世纪中叶，Gregor Mendel通过阐明分离和独立分配规律来解释生
物性状的遗传现象，提出了遗传因子(hereditary factor)的概念，他将
控制豌豆性状的遗传因素称为遗传因子，形成了基因的雏型。1909年，丹麦遗传学家W.Johanssen根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一
词。之后，随着T.h.Morgan、O.T.Avery、J.Watson和F.Crike等人的工
作，人们对基因的概念逐渐形成。基因(gene)是一段可以编码具有某
种生物学功能物质的核苷酸序列。基因的研究为基因工程的创立奠定了
坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；而基因
工程技术的发展和应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，使我们对
基因的研究提到了空前的高度。随着研究的进一步深入，科学家提出了
移动基因(又称为转位因子，transposable elements)、断裂基因(split
gene)、假基因(pseudogene)、重叠基因(overlapping genes)或嵌套
基因(nested genes)等基因的现代概念。
基因具有以下特点：
①不同基因具有相同的物质基础。原则上，所有生物的DNA都是可
以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，它们的
基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物
的DNA结构都是一样的。有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒
RNA可以通过反转录产生cDNA，并不影响不同基因的重组互换。
②基因是可以切割的。基因在染色体上的存在形式是直线排列。大
多数基因彼此之间存在着间隔，少数基因是重叠排列的。
③基因是可以转移的。生物体内有的基因是可以在染色体上移动
的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。基因在转
移的过程中就完成了基因间的重组。
④多肽与基因之间存在对应关系。现在普遍认为，一种多肽就有一
种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的
性质来检查。
⑤遗传密码是通用的。一系列的三联密码子(除极少数外)同氨基
酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。
⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。经重组的基因一般
来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。
基因工程(genetic engineering)也叫基因操作、遗传工程或重组
DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质(DNA片段)，在体外切割、拼接形成
重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入
到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的
产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。广义的基因
工程，是指DNA重组技术的产业化设计与应用，分为上游和下游技术。
上游技术包括外源基因重组、克隆和表达的设计与构建，即狭义的基因
工程。下游技术包括含有外源基因的生物细胞(基因工程菌或细胞)的
大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。按目的基因的克隆
和表达系统的不同，基因工程分为原核生物基因工程、酵母基因工程、植物基因工程和动物基因工程。
基因工程有两个重要的特征，一是可以通过一定的技术手段把来自
供体的基因转移到受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生
物的遗传特性，创造出生物的新性状；二是某一段DNA可在受体细胞内
进行复制，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学
的研究领域。
1.2基因工程的诞生和发展
1.2.1基因工程的诞生
由于分子生物学和分子遗传学发展的影响，基因分子生物学的研究
也取得了前所未有的进步，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。
这些成就主要包括3个方面：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的
携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物
质基础问题；第二，是在20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模
型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递的问题；第三，是
在20世纪50年代末和60年代初，相继提出了中心法则和操纵子学说，并
成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。随着
DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们的眼前，特别是
当人们了解到遗传密码是由信使RNA转录表达以后，生物学家不再仅仅
满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子水
平上去干预生物的遗传特性。如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码
片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，不就
可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型吗？
这与过去培育生物新品种的传统做法完全不同，它很像技术科学的工程
设计，即按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那
个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种
完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就
被称为“基因工程”，或者称为“遗传工程”。
由于基因工程是一门内容广泛、综合性的生物技术学科，在20世纪60年代科学发展的水平下真正实施基因工程，还存在许多问题，特别是
在技术方面。生物有机体，尤其是具有复杂结构的真核生物，其DNA含
量是十分庞大的。首先要解决的是DNA核苷酸序列的整体结构问题，能
否有效地分离单基因，以实现在体外对它的结构与功能进行深入的研
究，是进行基因操作的重要环节。在20世纪70年代两项关键技术(DNA
分子的切割与连接技术、DNA的核苷酸序列分析技术)从根本上解决了
DNA的结构分析问题。基因操作的第二大技术是载体的使用。在20世纪
70年代，将外源DNA分子导入大肠杆菌的转化获得成功，1972年美国斯
坦福大学的S.Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能
够摄取质粒的DNA。从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的转化受
体。不到四年，世界上第一家基因工程公司“Genetech”注册登记，意味
着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。随着1970年逆转录酶的
发现，无论在理论上还是技术上都已经具备了开展DNA重组工作的条
件。1972年，美国斯坦福大学的p.Berg博士领导的研究小组，率先完成
了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，并提出了体外重组的DNA
分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。在
20世纪60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这
对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。
1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时与
S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重
组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已
正式问世，并说明了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因
导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到原核生物细胞中并
在其中实现功能表达。
1.2.2基因工程的发展
自基因工程问世以后的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。如
果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，那么21世纪初将
是基因工程应用研究的鼎盛时期。第2章 基因工程研究的主要内容
1.3.1基因工程的基本过程
对于整个基因操作过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及
产物，而且还影响到产物的量。在基因操作过程中，目的基因是很难获
得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。
如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过pCR或
cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性。基因工程主要
包括以下过程：
(1)材料准备：包括目的基因的制备、受体细胞(宿主)的准
备；
(2)制备重组载体DNA：包括选择合适的载体，用限制性内切酶
分别将外源DNA和载体分子切开，将目的基因与载体于体外重组，形成
重组载体DNA分子；
(3)重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系；
(4)筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中
稳定遗传、正确表达；
(5)表达的外源蛋白的分离纯化。
概括地说，基因工程的过程包括目的基因的获得、载体制备、重组
体制备、基因转移、基因表达、产品分离纯化等。
1.3.2基因工程研究的主要内容
(1)从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或pCR扩增等
步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；
(2)在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复
制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；
(3)将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(宿主细胞)，并与
之一起增殖；
(4)从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子
的受体细胞克隆；
(5)从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目
的基因，供进一步分析研究使用；
(6)将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的
遗传背景下实现功能表达，生产出人类所需要的物质。
基因工程的主体思想是获得外源基因的高效表达，可从四方面达到
目的：
①利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特
性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。
②筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上
游调控序列、操作子、终止子。
③修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。
④工程菌(微型生物反应器)的稳定生产及增殖。
1.4基因工程的研究意义
虽然基因工程的出现给人类带来了一些生物安全性问题，尤其是经
基因工程改造的转基因食品，使人们产生了疑虑和担心，但是实践表
明，基因工程将产生难以估计的经济效益和社会效益，特别是在解决人
类所面临的粮食、能源、疾病、环境等问题。基因工程技术已经在医
学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用，必将为人类作出巨大贡
献。
1.4.1基因工程技术在医学领域中的应用
1.基因工程制药或疫苗
生产基因工程药物的基本方法是，将目的基因用DNA重组的方法连
接在载体上，然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组
织靶细胞)，使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白
质提纯及制成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。
目前，已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新
药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人胰岛素、尿激酶、红细胞生成
素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。具有
高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制
药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏
儒症等提供了有效的药物。2001年全球生物技术公司总数已达4284家，其中上市公司有622家，销售总额约为348亿美元，其中基因药物的销售
额为250亿美元，占总销售额的70%。美国至今已批准了120多种基因工
程药物上市，还有近400种处于临床研究阶段，约3000种处于临床前研
究阶段，基因工程药物的产值和销售额已超过200亿美元。每年平均有
3~4个新药或疫苗问世，在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化
学药物难以达到的作用。
治疗糖尿病的胰岛素，是一种由51个氨基酸残基组成的蛋白质，1982年美国EliLilly公司推出利用基因工程技术制造的人胰岛素，商品名
为humulin。传统的生产方法是从牛的胰脏中提取，每1000磅牛胰脏才
能得到10克胰岛素。通过基因工程方法，把编码胰岛素的基因转入大肠
杆菌细胞中去，造出能生产胰岛素的工程菌，从200升发酵液就可得到
10克胰岛素。
干扰素(interferon,IFN)是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。它是人和动物细胞受
到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后，由受
体细胞分泌的一种具有高度生物学活性的糖蛋白。干扰素被发现时，人
们以为其抗病毒活性为其唯一特性，随着研究的不断深入，人们逐渐发
现IFN除了具有抗病毒活性外，还具有免疫调节、抗肿瘤等生物学功
能。但是，通常情况下人体内干扰素基因处于“睡眠”状态，因而血液中
一般测不到干扰素。即使经过诱导，从人血中提取1mg干扰素，还是需
要人血8000mL，其成本高得惊人。据计算，要获取1磅(453g)纯干扰
素，其成本高达200亿美元，使大多数病人没有使用干扰素的能力。
1980年后，干扰素与乙肝疫苗一样，采用基因工程技术进行生产，其基
本原理及操作流程与乙肝疫苗十分类似。现在要获取1磅(453g)纯干
扰素，其成本不到1亿美元。从人血中分离纯化干扰素治疗一个肝炎病
人的费用高达二三万美元，用基因工程技术生产干扰素治疗一个肝炎病
人大约只需二三百美元。基因工程生产出来的大量干扰素，是基因工程
药物对人类的又一重大贡献。
常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种
疫苗各有自身的弱点，活疫苗隐含着感染的危险性，死疫苗免疫活性不
高，需加大注射量或多次接种。利用基因工程制备重组亚基疫苗，可以
克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含
病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白
质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中而大量生产。
这样得到的亚基疫苗往往效价很高，但绝无感染毒性等危险。
防治乙肝的方法是把一定量的hBsAg(乙肝病毒hBV的外壳蛋白)
注射入人体，就使机体产生对hBV抗衡的抗体。传统乙肝疫苗的来源，主要是从hBV携带者的血液中分离出来的hBsAg，但这种血液中可能混
有其他病原体，而且血液来源也是极有限的，使乙肝疫苗的供应远不能
满足需要。基因工程疫苗解决了这一难题。在酵母中表达乙型肝炎表面
抗原hBsAg产量可达每升2.5mg，已于1984年问世。建立在重组hBs病毒
样颗粒的基因工程乙肝疫苗纯度高，免疫效果好，美国于1986年首先批
准了基因工程乙肝疫苗的生产。来源于酵母菌的hBs疫苗不仅是首次，也是至今唯一批准的重组疫苗。截至2000年3月已有116个国家将乙肝疫
苗纳入常规免疫接种项目中。然而疫苗逃避突变的出现提出了如何改进
的问题，综合策略是增加靶(B细胞、T细胞和CTL表位)的数量，例如
来源于prS、核心蛋白质等其他hBV的抗原，这样一个或一些突变不至
于使病毒逃避免疫监测。目前已研制的包含pres的肝核心疫苗能够加强
和加快细胞和体液免疫应答，解决抗hBs的非应答。其他包含pres的hBs
疫苗的候选疫苗具有快的血清保护和预防决定簇α逃避突变的作用。已有研究显示外源性和细胞内产生的hBc有导致细胞应答的潜能，能够控
制hBV病毒，并最后消灭hBV感染。因此，hBc颗粒独异的免疫特性以
及CTL表位等都可能为新的治疗性hBV疫苗的发展提供机会。
2.基因工程用于基因治疗
人体基因的缺失，将导致一些遗传疾病。若将缺失的目的基因用
DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入人体组织靶细胞，使目
的基因表达，达到治疗的目的，即基因治疗，这已成为基因工程在医学
方面应用的又一重要内容。1979—1980年，美国加州大学洛杉矶分校的
研究员Martin Cline博士进行了人类历史上第一次替代基因治疗，将重组
DNA转入来自意大利和以色列的2例遗传性血液病患者的骨髓细胞中，由于此次治疗事前并未征得加州大学主管部门及RAC的批准，也未向患
者所在国家政府部门详细通报有关情况，因此遭到了社会舆论的谴责。
1990年9月14日，Blease等做了人类历史上经批准的第一次基因治疗，受
试对象为1例4岁严重复合性免疫缺陷(severe combined
immunodeficiency，SCID)患儿，SCID为腺苷脱氨酶(adenosine
deaminase，ADA)缺乏所致，患儿生活在免疫隔离状态下。治疗时，先提取患儿适量白细胞，经实验室处理，插入正常人ADA基因后，再输
入患儿体内，治疗后患儿免疫力增强，不再反复发生感冒，并可上学。
目前，基因治疗的前期与临床研究绝大部分是针对肿瘤的。治疗方
案的设计包括目的基因的选择、载体的选择及治疗方式的选择等。方案
设计的原则是最大限度地满足有效性、安全性和特异性三方面的要求，其中特异性与有效性和安全性均有关系。在基因治疗的病毒载体选择方
面，应用最早的为逆转录病毒载体。由于病毒滴度低，以及可能存在的
插入突变、同源重组等，使其应用受到限制。但由于逆转录病毒可持久
表达，无需反复应用，且只感染“生长”性细胞，特别是生长旺盛的癌细
胞，使治疗具有一定的针对性，这在很大程度上避免了外源基因对正常
组织的损伤，所以，逆转录病毒仍具有一定的优势。目前研究较多的病
毒载体为腺病毒及腺病毒相关病毒。腺病毒虽然感染性强，滴度高，但
不能在细胞内持久表达，因为腺病毒基因不能插入宿主染色体内，且能
引起宿主强烈的免疫反应，致使宿主器官严重损害而危及生命。1999年
9月13日，美国宾州大学人类基因治疗研究所利用腺病毒作载体对一名
18岁患者进行鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因治疗，4天后患者死亡，死亡
原因为腺病毒引起的免疫反应导致重症肝炎、多器官功能衰竭。因此，腺病毒作为载体的安全性令人担忧。
现有的胰岛素治疗方法包括胰岛素泵、胰岛细胞及胰腺的移植等，均存在许多弊端，如低血糖、供体不足、免疫排斥等。基因工程细胞能
模拟正常胰岛β细胞的功能，表达、储存、分泌胰岛素并实现葡萄糖介导的胰岛素分泌，可用于糖尿病胰岛素替代治疗。用于糖尿病基因治疗
的细胞系包括神经内分泌细胞和非神经内分泌细胞。将葡萄糖转运子
2、葡萄糖激酶、细胞外信号调节激酶12、CD38、胰十二指肠同源盒1
等基因导入神经内分泌细胞系ArT20、RIN、BTC、MIN、GTC1，可使
它们具有葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力；将点突变的胰岛素基因、furin
及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、含葡萄糖反应元件、葡萄糖6磷酸
酶基因的启动子等转入各种非神经内分泌细胞系中，也实现了胰岛素基
因的调控表达和分泌，并产生成熟的胰岛素。无论是神经内分泌细胞，还是非神经内分泌细胞经基因修饰、改建后均可大量分泌具有生物活性
的胰岛素，但胰岛素表达的调控，特别是葡萄糖调控下的胰岛素基因的
表达及胰岛素分泌还未较好地解决，这也是今后研究的方向。如何将具
有治疗作用的基因工程细胞导入糖尿病动物体内甚至糖尿病患者体内，使其在体内能正常发挥作用仍是糖尿病基因治疗中需要解决的问题。
1.4.2基因工程在农业领域中的应用
1983年首例转基因作物(烟草、马铃薯)问世，1986年首批转基因
作物批准进行田间试验，1992年中国成为世界上第一个商品化种植转基
因作物的国家，开创了转基因作物商品化应用的先河。当时种植的是一
种抗黄瓜花叶病毒(CMV)和抗烟草花叶病毒(TMV)的双价转基因
烟草，种植面积达到8600公顷。1994年美国孟山都公司下属Calgene公
司研制的延熟保鲜转基因番茄在美国批准上市，这是发达国家批准商业
化的第一个转基因作物。随后，转基因作物的商业化种植面积和经济效
益迅速扩大。在过去的十几年里，全球转基因植物的种植面积由1996年
的170万公顷增长到了2007年的1.143亿公顷。我国实施“863”计划多年
来，生物技术水平不断提高，生物技术产业也初具规模，应用生物技术
育种的许多转基因作物得到大面积的推广。
运用基因工程技术，把特定的基因转入农作物中，构建转基因植
物，具有抗虫害，抗病毒、细菌和真菌病害，抗除草剂，良好的开花习
性(如开花时间和花色)，良好的果实和球茎成熟储藏特性(如延迟成
熟、延长花架期的番茄、减少马铃薯储藏是使用发芽抑制剂用量)，抗
逆(如冷、热、渍、旱和盐碱土壤)，保鲜，高产，高质的优点。例
如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)所产生的毒素蛋白(BT)
对许多鳞翅类害虫有杀灭作用，已有喷洒苏云金芽孢杆菌发酵产物或提
纯了的BT于农作物叶面，用于虫害防治的实验。1996年浙江农业大学
核农所教授高明尉等带领课题组运用转基因技术将苏云金杆菌的杀虫蛋
白基因(Bt基因)导入水稻，并于1998年获得了抗螟虫的种质资源克螟
稻1号和2号。克螟稻稳定地传递和表达了抗螟基因，对常见的二化螟、三化螟和纵卷叶具有高度的抗性，危害水稻的螟虫的幼虫一旦吃了这种水稻的茎叶，两天之内就会死亡。另外，转基因动物实验首先在小鼠获
得成功，之后随着“多莉”羊、恒河猴等动物转基因实验的不断成功，现
在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从牛羊奶中可以生产蛋白质药
物，称为“乳腺反应器”工程。把生长激素基因转入奶牛或肉牛，提高牛
奶产量，提高饲料转化率等等，亦有实验报道。但是，转基因植物动
物真正达到实际应用，还需许多基础研究，还有很长的路要走。
1.4.3基因工程在工业领域中的应用
除转基因动物和植物外，工程菌也获得了快速的发展，并在环境工
程、工业生产等领域得到广泛的应用。油轮的海上事故常常使海面和海
岸产生严重的石油污染，造成生态问题。早在1979年美国GEC公司构建
成具有较大分解烃基能力的工程菌，并经美国联邦最高法院裁定，获得
专利。这是第一例基因工程菌专利。无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻基因工
程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交
流，迅速并定向地获得人类需要的新的生物类型。
酿酒、食品、发酵、酶制剂等工业门类均利用微生物代谢过程。基
因工程方法在改造所用微生物的特性中有极大潜力，因此，可以应用在
工业生产的许多方面，提高质量、改进工艺或发展新产品。在啤酒酿造
中，主要的发酵微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，酿酒
酵母可把麦芽汁中的葡萄糖、麦芽糖、麦芽二糖等成分转变成乙醇。但
是麦芽汁中还有约占碳水化合物总数20%的糊精不能被酿酒酵母利用。
另一种酵母叫糖化酵母(S.diastaticus)，能分泌把糊精切开成为葡萄糖
的酶，但由此生产的啤酒口味不好。用基因工程技术，把糖化酵母中编
码切开糊精的酶的DNA基因引入酿酒酵母中，这样的酿酒酵母工程菌能
最大限度地利用麦芽中的糖成分，使啤酒产量大为提高，并且因为残余
糊精量的降低，亦提高了啤酒的质量。在白酒和黄酒的酿造中，常用霉
菌产生的淀粉水解酶使淀粉糖化，然后由酿酒酵母把糖转化为乙醇，淀
粉需先经高温蒸煮，淀粉颗粒溶胀糊化，才能被霉菌产生的淀粉糖化酶
所作用。蒸煮消耗的能量甚多，不少实验室已经试验将淀粉糖化酶基的
基因转入酿酒酵母，使淀粉糖化及乙醇发酵两步操作均由酵母来完成，并且力求免去蒸煮过程，可以大大节约能源。干酪是高附加值奶制品，且有极高的营养价值。制造干酪需要大量的凝乳酶。传统的方法是从哺
乳小牛的第四个胃中提取凝乳酶粗制品，这当然很不经济。现在已经做
到将小牛的凝乳酶基因转入酿酒酵母中去，经酵母菌培养生产出大量具
天然活性的凝乳酶，用于干酪制造业。近来把乳酸克鲁维酵母
(Kluyveromyces lactis)的水解乳糖的基因转入酿酒酵母，使得可利用
乳清发酵来产生酒精。
本章小结本章简要介绍了基因工程的概念、基因工程诞生的基本理论基础和
技术基础、基因工程的发展，以及基因工程的研究内容、基本过程和基
本原理，并用实例说明基因工程在医学、农业、工业等领域中的应用。第3章 限制性核酸内切酶
在基因工程中，大量应用的是作用于核酸的酶。生物体内与核酸有
关的酶很多，例如核酸聚合酶、核酸水解酶等。核酸酶类是基因工程操
作中必不可少的工具酶，基因克隆的许多步骤都需要使用一系列功能各
异的核酸酶来完成。本章主要介绍以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等为主的多种核酸酶的性质和用途。
2.1.1限制性核酸内切酶的发现
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。在20世纪50年代，人们在研究噬菌体的宿主范
围时，发现在不同大肠杆菌菌株(例如K菌株和B菌株)上生长的λ噬菌
体(分别称为λ。K和λ。B)能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞K
菌株和B菌株，但当它们分别与其宿主菌交叉混合培养时，则感染频率
下降。一旦λ。K噬菌体在B菌株中感染成功，由B菌株繁殖出的噬菌体
的后代便能像λ。B一样高频感染B菌株，但却不再感染它原来的宿主K
菌株，原因是大肠杆菌K菌株和B菌株中含有各自不同的限制与修饰系
统，λ。K和λ。B分别长期寄生在大肠杆菌的K菌株和B菌株中，宿主细
胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了
自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。当外来DNA入侵时，便遭
到宿主限制性核酸内切酶的特异性降解。在降解过程中，偶尔会有极少
数的外来DNA分子幸免而得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿
主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主
菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。这种由宿主控制的对外
源DNA的限制(restriction)和对内源DNA的修饰(modification)现象
称为宿主细胞的限制和修饰作用。
几乎所有的细菌都能产生限制性核酸内切酶。由于限制性核酸内切
酶的发现，基因操作才成为可能。为此，在发现限制性核酸内切酶工作
中做出突出贡献的科学家W.Arber、h.Smith和D.Nathans荣获了1978年度
诺贝尔生理学或医学奖。
宿主细胞的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中，它有两方面的
作用，一是保护自身DNA不受限制；二是破坏入侵的外源DNA，使之
降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。
外源DNA可以通过多种方式进入某一生物体内，但是它必须被修饰成受
体细胞的限制性内切酶无法辨认的结构形式，才能在宿主细胞内得以生
存，否则会很快被破坏。因此，在基因工程中，常采用缺少限制作用的
菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。例如，大肠杆菌K12的限
制缺陷型R—km+k，不能降解外源DNA，但具有修饰功能，这类突变株经常用于转化实验。R—km—k属于限制和修饰缺陷型，既无限制功
能，又无修饰功能，也常用于转化实验。
2.1.2限制性核酸内切酶的分类
目前已经鉴定出三种不同类型的限制性核酸内切酶，M.Meselson和
R.Yuan(1968)最早从大肠杆菌的限制与修饰系统中分离到限制性核酸
内切酶，这种酶后来被命名为Ⅰ型限制性核酸内切酶。Ⅰ型限制性核酸
内切酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATp酶和DNA解旋酶四种活性，其
切割作用是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位
置上切割，不产生特异片段。因此，Ⅰ型限制性核酸内切酶在基因操作
中没有实用价值。
1970年，h.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血杆菌
(haemophilus influenzae)分离出第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶
hindⅡ。Ⅱ型限制性核酸内切酶仅需要Mg2+，可识别双链DNA分子上
的特定序列，并且其切割位点与识别位点重叠或靠近，产生具有一定长
度的DNA片段，因此在基因克隆中广泛使用。
Ⅲ型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限
制与修饰双重作用，其中M亚基负责位点的识别与修饰，R亚基具有核
酸酶活性，酶的切割作用需要ATp、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸等辅助因
子。切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与
识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同，在基因克隆中很少
使用Ⅲ型限制性核酸内切酶。
2.1.3限制性核酸内切酶的命名以及识别特点
由于发现的限制性核酸内切酶越来越多，所以需要有一个统一的命
名规则。h.O.Smith和D.Nathans于1973年提议的命名系统已被广大学者
所接受。他们提议的命名原则包括以下几点：
(1)用具有某种限制性内切酶有机体属名的第一个字母(大写)
和种名的前两个字母(小写)组成酶的基本名称。例如大肠杆菌
(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(haemophilus influenzae)
用hin表示。
(2)用一个写在右方的字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制
与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的宿主菌的种名
右方附加一个标注字母，表示这是染色体外的成分。
(3)如果一种特殊的菌株中，具有几个不同的限制修饰体系，则
以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如，流感嗜血菌
Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为hindⅠ，hind Ⅱ，hind Ⅲ等，hind Ⅲ是在haemophilus influenzae(流感嗜血杆菌)的d菌株中发现的第
三个酶；EcoR I表示在Escherichia coli(大肠杆菌)中的抗药性R质粒上发现的第一个酶。
(4)有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系统名称。限制
性核酸内切酶的系统名称为R，甲基化酶为M。例如R.hind Ⅲ表示限制
性核酸内切酶，相应的甲基化酶用M.hind Ⅲ表示。但在实际应用中，限
制性内切酶的系统名称R常被省略。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别特点有以下方面：
(1)大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列长度为4～6个碱基
对，一般富含GC。有少数限制性内切酶可识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有酶，如Not I(GCGGCCGC)。
(2)识别序列具有双重旋转对称的回文结构(palindromic
sequence)。对称轴位于第三和第四位碱基之间；对于由5对碱基组成的
识别序列而言，其对称轴为中间的一对碱基。
2.1.4Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式
大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部水解磷酸二酯键
中3′位的酯键，产生3′端为羟基、5′端为磷酸基团的片段。切割后形成3
种不同末端结构的DNA片段：
①在识别序列的对称轴上同时切割，形成平端(blunt end)，如
Sma Ⅰ；
②在识别序列对称轴的5′端切割，产生5′端突出的末端，如EcoR
Ⅰ：
③在识别序列对称轴的3′端切割，产生3′端突出的末端，如pst Ⅰ。
任何一种Ⅱ型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互
补，因此这种末端称为黏性末端(cohesive end)。限制性核酸内切酶识
别的靶序列与DNA来源无关，根据这一特性，我们可以将任意两个不同
来源的DNA片段连接，构成一种新的重组DNA分子。
有些不同微生物来源的酶，能识别相同的序列，切割位点相同或不
同，其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶
(isoschizomer)。例如hpaⅡ与MspⅠ的识别序列和切割位点都相同
(C↓CGG)，它们是一对同裂酶，Sma Ⅰ(CCC↓GGG)和Xma
Ⅰ(C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不同，前者产生平头末
端，后者产生黏性末端。
2.1.5Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件
在合适的温度和缓冲液中，在20μL反应体系中，1h完全降解1μg
DNA所需要的酶量，称为一个单位的限制性核酸内切酶。加入的酶过
量，其贮存液中的甘油会影响反应，而且许多限制性核酸内切酶过量可
导致识别序列的特异性下降。当DNA酶切后不需进行进一步的酶反应
时，可加入酚氯仿抽提，然后乙醇沉淀，使酶终止反应。限制性核酸内切酶切割DNA是基因重组技术中的重要环节，直接关
系到整个实验的成败，因此在操作过程中，应注意下列问题：①浓缩的
酶液可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释(不能用水稀释，以免酶变
性)，稀释的酶液不能保存过长时间，要尽快用完。②限制性核酸内切
酶在含50%甘油的缓冲液中，于—20℃稳定保存。一般总是在其他试剂
加完后，再加入限制性核酸内切酶。每次取酶必须使用新的无菌吸头。
应尽快操作避免反复冻融。
2.1.6影响限制性核酸内切酶活性的因素
1.DNA的纯度
限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率在很大程度上取决于所
使用的DNA本身的纯度。DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯
仿、酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠(SDS)以及高浓度的盐离
子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。应用微量碱抽提法制备
的DNA制剂，常常含有这类杂质。为了提高限制性核酸内切酶对低纯度
DNA制剂的反应效率，一般采用增加限制性核酸内切酶的用量，扩大酶
催化反应的体积和延长酶催化反应的保温时间等措施。
2.DNA的甲基化程度
限制性核酸内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识
别序列中特定核苷酸的甲基化作用便会强烈地影响酶的活性。通常从大
肠杆菌宿主细胞中分离出来的质粒DNA，都混有两种作用于特定核苷酸
序列的甲基化酶，一种是dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残
基甲基化；另一种是dcm甲基化酶。因此，从正常的大肠杆菌菌株中分
离出来的质粒DNA，只能被限制性核酸内切酶局部消化，甚至完全不被
消化，是属于对甲基化作用敏感的一类。
为了避免产生这样的问题，在基因工程操作中通常使用丧失了甲基
化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。哺乳动物的DNA有时也会带有5甲
基胞嘧啶残基，而且通常是在鸟嘌呤核苷残基的5′侧。因此，不同位点
之间的甲基化程度是互不相同的，且与DNA来源的细胞类型有密切的关
系。可以根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性对真核基因组
DNA的甲基化作用模式进行研究。例如，当CCGG序列中内部胞嘧啶残
基被甲基化之后，MspⅠ仍会将它切割，而hpaⅡ(正常情况下能切割
CCCG序列)对此类的甲基化作用则十分敏感。
限制性核酸内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，这种特性在有
些情况下具有特殊的用途。例如，当甲基化酶的识别序列同某些限制酶
的识别序列相邻时，就会抑制限制酶在这些位点发生切割作用，这样便
改变了限制酶识别序列的特异性。另一方面，若要使用合成的衔接物修
饰DNA片段的末端，一个重要的处理是必须在被酶切之前，通过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。
3.酶切反应的温度
DNA消化反应的温度是影响限制性核酸内切酶活性的另一重要因
素。不同的限制性核酸内切酶具有不同的最适反应温度，而且彼此之间
有相当大的变动范围。大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是
37℃，但也有许多例外的情况，有些限制性核酸内切酶的标准反应温度
低于标准的37℃，例如SmaⅠ是25℃，ApaⅠ是30℃。消化反应的温度
低于或高于最适温度都会影响限制性核酸内切酶的活性，甚至导致酶的
完全失活。
4.DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有很大的影响。
某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线
性的DNA高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些限制性核酸内
切酶切割位于DNA不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。
5.限制性核酸内切酶的缓冲液
限制性核酸内切酶的标准缓冲液的组分包括氯化镁、氯化钠或氯化
钾、Tris·hCl、β巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白
(BSA)等。酶活性的正常发挥，需要2价阳离子，通常是Mg2+。不正
确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识
别序列特异性的改变。缓冲液Tris·hCl的作用在于，使反应混合物的ph
值恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大多数限制酶来说，在
ph=7.4的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保护某些限制性核酸内切
酶的稳定性是有用的，而且还可使其免于失活。在“非最适的”反应条件
下(包括高浓度的限制性核酸内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用
Mn2+取代Mg2+以及高ph值等等)，有些限制性核酸内切酶识别序列的
特异性会发生改变，导致从识别序列以外的其他位点切割DNA分子。有
的限制性核酸内切酶在缓冲液成分的影响下会产生所谓的“星号”活性。第4章 DNA连接酶
2.2.1连接机理
1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在两条
DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(DNA ligase)。
DNA连接酶广泛存在于各种生物体内。在大肠杆菌及其他细菌中，DNA连接酶催化的连接反应是利用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作
为能源；在动物细胞及噬菌体中，DNA连接酶则是利用ATp(腺苷三磷
酸)作为能源。其催化的基本反应是将一条DNA链上的3′末端游离羟基
与另一条DNA链上的5′末端磷酸基团共价结合形成3′，5′磷酸二酯键，使两个断裂的DNA片段连接起来，因此它在DNA复制、修复以及体内
体外重组过程中起着重要作用。
DNA连接酶催化的连接反应分为三步：
①由ATp(或NAD+)提供AMp，形成酶AMp复合物，同时释放出
焦磷酸基团(ppi)或烟酰胺单核苷酸(NMN)；
②激活的AMp结合在DNA链5′端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键
的焦磷酸酯键；
③与相邻DNA链3′端羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMp。
值得注意的是，DNA连接酶所连接的是切口(nick)，无法连接裂
口。另外，DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA
分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
2.2.2DNA连接酶的种类
已发现的DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶(又称
T4DNA连接酶)和大肠杆菌DNA连接酶。
T4噬菌体DNA连接酶(又称T4DNA连接酶)的相对分子质量为
68000，最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。T4噬菌体DNA连
接酶可以连接：
①两个带有互补黏性末端的双链DNA分子；
②两个带有平头末端的双链DNA分子；
③一条链带有切口的双链DNA分子；
④RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA
链连接。由于T4噬菌体DNA连接酶可连接的底物范围广，尤其是能有
效地连接DNA分子的平头末端，因此在DNA体外重组技术中广泛应
用。
虽然两个完全断开的平头末端DNA分子在T4噬菌体DNA连接酶作
用下可以连接，但是连接速度非常缓慢，因此需要回收大量的酶切片
段。在平头末端连接反应中，若加入适量的一价阳离子和低浓度的pEG，可提高T4噬菌体DNA连接酶对平头末端的连接活性。
大肠杆菌DNA连接酶的相对分子质量为75000，需要NAD+作辅助
因子。大肠杆菌DNA连接酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连
接，它的适合底物是一条链带切口的双链DNA分子和具有同源互补黏性
末端的不同DNA片段。
2.2.3DNA连接酶的反应体系
由于T4噬菌体DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平头末
端，所以比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛。T4噬菌体DNA连接酶的活
性单位有多种定义，较通用的是韦氏(Weiss)单位。一个韦氏单位是
指在37℃，20min内催化1nmol32p从焦磷酸根置换到γ，β32pATp所需要
的酶量。
连接反应根据DNA片段的分子大小及末端结构，在12～30℃下反应
1～16h。对于黏性末端一般在12～16℃之间进行反应，以保证黏性末端
退火及酶活性、反应速率之间的平衡。平头末端连接反应可在室温进
行，并且需用比黏性末端连接大10～100倍的酶量。终止反应可加人
2μL0.5molL的EDTA或者75℃水浴10min。
2.2.4影响连接反应的因素
DNA片段的连接过程与许多因素有关，如DNA末端的结构、DNA
片段的浓度和相对分子质量、不同DNA末端的相对浓度、反应温度、离
子浓度等。
重组子的分子构型与DNA片段浓度及DNA分子长度存在密切关
系。对于长度一定的DNA分子，其浓度降低有利于分子环化。DNA浓
度增加，有利于分子间的连接，形成线性二聚体或多聚体分子。对于两
个以上的DNA分子的连接，如载体DNA与外源插入片段，要考虑载体
与插入片段的末端浓度的比例。
对于黏性末端，一般在12～16℃之间进行反应。平头末端连接反应
的最适温度一般为10～20℃，温度过高(>30℃)会导致T4噬菌体DNA
连接酶的不稳定。
DNA聚合酶
DNA聚合酶(DNA polymerase)催化以DNA为模板合成DNA的反
应。它能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链
DNA分子引物链的3′Oh末端，催化核苷酸的聚合作用。根据DNA聚合
酶所使用的模板不同，将其分为两类：
①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(全
酶)、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等；
②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
目前，已从大肠杆菌中分离到三种不同类型的DNA聚合酶，即
DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。在大肠杆菌中，DNA
聚合酶Ⅰ和DNA聚合酶Ⅱ的主要功能是参与DNA的修复，而DNA聚合
酶Ⅲ与DNA复制有关。在分子克隆中常用的是DNA聚合酶Ⅰ。
DNA聚合酶Ⅰ也称为Kronberg酶，是Kronberg等于1956年发现的第
一个DNA聚合酶。它具有3种活性，即5′→3′DNA聚合酶活性、5′→3′外
切酶活性和3′→5′外切酶活性。3′→5′外切酶活性的主要功能是识别并切
除错配碱基，通过这种校正作用保证DNA复制的准确性。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的主要用途是通过DNA切口平移来制备杂
交探针。在Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶Ⅰ(DNase Ⅰ)处理双链
DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性
和聚合酶活性可以同时发生。外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个
核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。由于大肠杆
菌DNA聚合酶Ⅰ不能使断裂处的5′p和3′Oh形成磷酸二酯键而连接，所
以随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象称为切口
平移(nick translation)。如果在反应体系中加入放射性核素标记的核苷
酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA
分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针。
2.3.2Klenow片段
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌蛋白酶处理后可切割产生两个大
小片段，其中较大的片段具有聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，称为
Klenow片段或Klenow聚合酶。较小的片段具有5′→3′外切酶活性，定位
于酶分子的N末端；Klenow片段具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活
性。
在分子克隆中，Klenow酶的主要用途是：
①补平DNA的3′凹陷末端，包括带裂口的双链DNA的修复；
②对带3′凹陷末端的DNA分子进行末端标记；
③在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；
④用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA的序列分析。
与切口平移法不同，DNA末端标记并不是将DNA片段的全长进行
标记，而是只将其一端(5′或3′)进行部分标记。在使用Klenow酶进行
DNA末端标记时，DNA片段应具有3′凹陷末端。Klenow酶不能直接用
于3′突出末端DNA的标记。
2.3.3T4噬菌体DNA聚合酶
T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，相对分子质量为1140。具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，而且3′→5′外
切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强，T4DNA聚合酶的外切
酶活性比Klenow酶高100～1000倍。
T4噬菌体DNA聚合酶可以补平或标记带3′凹陷末端的DNA分子，还
可进行平头末端或3′突出末端的双链DNA的标记以及特异探针的制备。
另外，T4噬菌体DNA聚合酶还能将双链DNA的末端转化成平头末端。
2.3.4T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶
T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是所有已
知的DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个酶。此外，T7噬菌体DNA
聚合酶还具有很强的对单链和双链DNA的3′→5′外切酶活性，其活性约
为Klenow酶的1000倍。T7噬菌体DNA聚合酶在分子克隆中主要用于催
化大分子模板(如M13噬菌体)的引物延伸反应，它可以在同一引物模
板上有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构的影响；也可类似T4噬菌
体DNA聚合酶应用于DNA分子的3′末端标记。
测序酶是通过化学修饰或基因工程方法对T7噬菌体DNA聚合酶进
行改造的酶，它不具备T7噬菌体DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性，保留
其聚合活性，具有很强的持续合成能力，是Sanger双脱氧末端终止法对
长片段DNA进行测序的理想用酶。
2.3.5Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是第一个被发现的耐热的DNA聚合酶，它最初是从
极度嗜热的栖热水生菌(Thermus aquaticus)中纯化而来的。Taq DNA
聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，需要Mg2+作辅助因
子，最适温度为75～80℃。由于Taq DNA聚合酶具有高度的耐热性，所
以在分子克隆中主要是通过聚合酶链反应(pCR)对DNA分子的特定序
列进行体外扩增。
已从多种耐热菌中分离出耐热性更好的DNA聚合酶，如从Thermus
thermophilus中分离出来的Tth DNA聚合酶，从Thermococcus litoralis中
分离出来的“Vent”DNA聚合酶，从Bacillus stermophilus中分离出来的Bst
DNA聚合酶等。
2.3.6逆转录酶
逆转录酶(reverse transcriptase)又称为RNA指导的DNA聚合酶。
已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，现在常用的两种逆转录酶
分别来自纯化的鸟类骨髓母细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)和Moloney鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)。AMV逆转录酶反应的最适温度为41～45℃，最适ph为8.3。
逆转录酶具有以下催化活性：
①5′→3′聚合酶活性，逆转录酶能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，但是后者的合成很慢；
②RNA酶h活性，能从5′或3′方向特异地降解DNA:RNA杂交分子中
的RNA链。
在体外以mRNA为模板合成其互补DNA是逆转录酶的最主要用途。
它可应用两种引物，一种是寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷，即oligo(dT)，另
一种是随机序列的核苷酸寡聚体。另外，逆转录酶还用于3′凹陷末端的
标记、杂交探针的制备和DNA序列测定。第5章 末端脱氧核苷酸转移酶
末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase)简称
末端转移酶。末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化DNA的聚合作
用，这种聚合作用不需要模板，反应需要Mg2+，其合适底物为带有
3′Oh突出末端的双链DNA。对于平头末端或带3′Oh凹陷末端的双链
DNA和单链DNA，末端转移酶催化的聚合作用仍能进行，但需Co2+激
活，且反应效率低。
在分子克隆中，末端转移酶的主要用途是给载体和外源DNA分别加
上互补的同聚体尾巴，以便两者在体外连接。末端转移酶的另一个用途
是进行DNA的3′Oh末端标记，标记物可以是放射性的，如α32pdNTp，也可以是非放射性的，如生物素11dUTp，它们可用于DNA序列分析、DNase Ⅰ足迹分析、分子杂交等实验中。
2.5S1核酸酶
S1核酸酶来源于米曲酶菌(Aspergillus oryzae)，是一种高度单链
特异的核酸内切酶。它可用于切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末
端、在双链cDNA合成时切除发夹环结构等实验操作中。通常水解单链
DNA的速率要比水解双链DNA快75000倍。这种酶需要低水平的Zn2+激
活，最适ph值范围为4.0~4.3。S1核酸酶作图(S1nuclease mapping)法
在测定杂交核酸分子(DNA∶DNA或DNA∶RNA)的杂交程度、RNA
分子定位、确定真核基因中内含子的位置、内含子与外显子剪切位点的
定位、转录起始位点与终止位点的测定中，都是十分有效的工具。
当克隆的基因组DNA片段与细胞的mRNA混合时，DNA中的外显
子序列与相应的mRNA之间通过碱基互补，形成杂合双链分子，而内含
子序列仍保持单链，并突出成为环状。用S1核酸酶处理，该酶能水解所
有的单链区域，结果得到一个因内含子被降解而带有切口的
DNA∶mRNA分子。再用碱处理破坏RNA链，回收的DNA片段就是该
基因的编码序列，其大小和数目可通过琼脂糖凝胶电泳来判断，所以用
这种方法可以测定内含子的大小。
2.6核酸外切酶
核酸外切酶(exonuclease)是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降
解核苷酸的酶。按照酶对底物二级结构的专一性，将其分为三类：①作
用于单链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ和大肠杆菌核酸外切
酶Ⅶ；
②作用于双链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ、λ噬菌体
核酸外切酶等；
③既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶。大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ可以从单链DNA的两个末端降解DNA分
子，产生短的寡核苷酸片段；对于带黏性末端的双链DNA，大肠杆菌核
酸外切酶Ⅶ可将末端削平，变为平头末端。反应不需要Mg2+。它主要
应用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置。
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ对双链DNA具有高度特异性，可降解平头末
端、3′凹陷末端及有切口的DNA，但不能降解单链DNA和带3′突出末端
的双链DNA，要求Mg2+或Mn2+作辅助因子。核酸外切酶Ⅲ的主要用途
是通过部分降解双链DNA片段，产生部分单链DNA区域，作为DNA聚
合酶的模板。生成的DNA分子可以用作特异探针的制备。
Bal31核酸酶来源于埃斯波加纳互生单胞菌
Bal31(Alteromonasespejiana Bal31)，主要表现为3′外切酶活性，同时
伴有5′外切及较弱的内切活性，需要Mg2+和Ca2+。对于单链DNA，具
有特异的内切酶活性，可从3′Oh末端迅速降解DNA，而5′端切割速率较
慢。对于双链DNA，具有3′→5′外切酶活性和5′→3′外切酶活性，可从3′
和5′两端切除核苷酸，其机理是以3′外切酶活性迅速降解一条链，随后
在互补链上进行缓慢的5′端内切反应。
2.7T4噬菌体多核苷酸激酶
T4噬菌体多核苷酸激酶(T4phage polynucleotide kinase)来源于T4
噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸
激酶。该酶具有多种功能，例如T4噬菌体多核苷酸激酶可催化ATp的γ
磷酸基团转移到单链或双链DNA或RNA的5′Oh末端。另外，它还具有3′
磷酸酶活性。T4噬菌体多核苷酸激酶能催化寡核苷酸的3′磷酸水解成为
3′Oh，底物可以是3′磷酸脱氧核苷、3′，5′二磷酸脱氧核苷和3′磷酸多核
苷酸。
在实际应用中，主要是利用多核苷酸激酶能进行DNA或RNA的5′末
端标记和在连接反应之前，使缺乏5′磷酸的DNA或接头磷酸化。
2.8碱性磷酸酶
常用的碱性磷酸酶有两种，一种来源于大肠杆菌，叫做细菌碱性磷
酸酶(bacterial alkaline phosphatase，BAp)；另一种来源于小牛肠，叫
做小牛肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIp)。小牛
肠碱性磷酸酶(CIp)的相对分子质量约为140000，是一种含Zn2+的金
属糖蛋白，由两个亚基组成。它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使
DNA或RNA的5′磷酸变为5′Oh末端。
CIp可在68℃10min内加热失活或通过酚抽提变性失活，而BAp则不
能。因为BAp对高温和去污剂的耐受性较强，故需要进行多次酚氯仿
抽提及凝胶电泳纯化DNA片段。此外，CIp的活性比BAp高10~20倍，所
以实验中一般选用CIp。碱性磷酸酶的主要用途有：
①5′末端标记前的处理；
②去除DNA片段的5′磷酸基团，防止自身连接。
在载体和目的基因的重组过程中，如果载体与外源DNA是使用同一
种限制性核酸内切酶消化的，则它们的连接产物有自身环化形式。为了
防止线性载体的自身环化作用，必须在连接之前使用碱性磷酸酶处理，去除其5′末端的磷酸基团。通过碱性磷酸酶预处理线性载体，有效防止
了载体的自身环化，提高了载体与外源DNA的连接效率，从而降低了细
菌转化时的背景。
本章小结
催化DNA各种特异性反应的酶是分子生物学家进行DNA操作的基
本工具。在分子克隆过程中，制备好目的DNA之后，下一步就是使用限
制性核酸内切酶将待克隆的DNA片段切割下来，与特异性切割的载体在
DNA连接酶作用下连接形成重组分子。这一系列操作不仅用到了限制性
核酸内切酶和DNA连接酶，而且还需要DNA聚合酶、核酸外切酶、多
核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶等的参与，以提高特异性DNA片段的连接效
率。由于以上各种酶类的发现，特别是限制性核酸内切酶和DNA连接酶
的应用，使不同分子之间的连接成为可能，而且分子克隆的方法不断创
新，基因克隆工作更加简单，应用范围更广。除了基因克隆外，其他研
究(如DNA的生化特性测定、基因的结构分析和基因表达调控研究
等)，也都要用到这些酶。可以说，几乎所有的DNA操作都离不开它
们。工具酶在基因工程中占据着极其重要的地位。
根据这些工具酶催化的反应类型，可将其分为四大类：
①核酸酶，用于切割或降解核酸分子；
②连接酶，可以把核酸分子连接起来；
③聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝；
④修饰酶，能够给核酸分子添加或去除核苷酸或某些化学基团。有
些酶兼有数种功能，如大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，除了能合成新的DNA
分子外，还有DNA外切降解作用。第6章 质粒载体
一个外源基因DNA进入细胞的几率非常低，在新的细胞内不能进行
复制和表达，原因主要是外源DNA不带有新细胞的复制系统，也不具备
宿主的功能表达调控系统，因此最终外源DNA会随着细胞分裂而丢失。
在基因克隆中，需要借助于一种运载工具，其携带外源基因进入宿主细
胞，并使外源基因持续稳定地复制表达，这种工具我们称之为载体
(vector)。
基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体等。载体的本质是DNA
复制子。目前使用得最多的载体是经过改造的质粒载体或噬菌体载体。
根据功能和用途不同，基因工程载体又可分为克隆载体、表达载体、测
序载体、穿梭载体等。克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁
殖的质粒载体，而表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外
源蛋白质的质粒载体。穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector)是指一类
由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的
宿主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以携带着外源
DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核细胞之间往返穿
梭，因此在基因工程研究工作中是十分有用的。常见的穿梭载体有大肠
杆菌土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体等。根据受体细胞不同，基因工程载体
又可分为原核生物载体、真核生物载体等。
作为基因工程的载体必须具备以下基本条件：
①具有复制子，能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。
②具有合适的限制性内切酶位点。在载体上每一种限制性核酸内切
酶的酶切位点最好是单一的，这样可以将不同限制性核酸内切酶切割后
的外源DNA片段准确地插入载体。
③具有合适的选择标记基因。最常用的标记基因是抗药性基因，如
抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素、抗卡那霉素等抗生素的抗性基
因。
④具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离
提纯。
⑤具有较小的相对分子质量，易于操作。
⑥具有较高的遗传稳定性。
在自然界中，质粒分布广泛，无论是真核生物细胞还是原核生物细
胞，都已经发现质粒的存在，它非常适合作为外源基因的载体在相应的
宿主细胞中复制、表达，是基因克隆操作中非常重要的工具。3.1.1质粒的基本特性
1.分子特性
质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。它广泛存在于细菌细
胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中
都发现有质粒的存在。质粒的大小从1kb到200kb以上不等。绝大多数质
粒都是双链闭合环状DNA分子。除了酵母的杀伤质粒(killer plasmid)
是一种RNA分子外，其他质粒都是DNA分子。
质粒DNA分子具有3种不同的构型：
①共价闭合环状DNA，其两条多核苷酸链均保持着完整的环状结
构，这样的DNA通常呈超螺旋构型，即SCDNA。
②开环DNA，其两条多核苷酸链只有一条保持着完整的环状结构，另一条链出现一至数个切口，此即OC构型。
③线形DNA，闭合环状DNA分子双链断裂成为线形DNA分子，此
即L构型。在体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶
电泳中，走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。
2.复制特性
根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或质粒在宿主细胞中拷贝数的
多少，可将质粒分成两种不同的复制类型：严紧型和松弛型。严紧型质
粒的复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，两者紧密相关，因此，质
粒在宿主细胞中拷贝数较少，一般只有1～3个拷贝。松弛型质粒的复制
受宿主的控制比较松，在宿主细胞中质粒拷贝数较多，一般有10～200
个拷贝，有时可达700个拷贝。因此，通常选用松弛型质粒作为基因工
程载体，以期获得高产量的重组质粒。
3.质粒的不亲和性
在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一个宿主细胞
系中稳定地共存的现象，称为质粒的不亲和性。原因可能是在细胞的增
殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉。质粒的不亲和性只有
在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的宿主细胞，在没
有选择压的情况下，这两种质粒不能长期稳定共存，在这种情况下认为
A和B是不亲和性质粒。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(incompatibility group)。
ColE1质粒和pMB1质粒及其派生质粒都是彼此不相容的，属于同一个不
亲和群。pSC101、F和Rp4质粒，它们归属于不同的不亲和群，所以这
些质粒或其派生的质粒载体，彼此能够在同一个细胞中稳定地共存。
4.质粒的转移性
质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。根据
质粒是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可将其分为接合型(conjugative)与非接合型(nonconjugative)两种。接合型质粒又叫自
我转移质粒，如F因子，其相对分子质量一般都较大，除了携带自主复
制所必需的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的
基因，因此能从一个细胞自我转移到另一个细胞中，它们多属于严紧型
质粒。非接合型质粒又叫不能自我转移质粒，如ColE1，其相对分子质
量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信息，但不携带控制细菌配对
和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞自我转移到另一个细胞
中。
从安全角度考虑，基因工程中所用的主要是非接合型质粒，这是因
为接合型质粒不仅能够从一个细胞转移到另一细胞，而且还能够转移染
色体。如果接合型质粒已经整合到细菌染色体的结构上，就会牵动染色
体发生高频率的转移。在基因工程中所用的非接合型质粒载体缺乏转移
所必需的mob基因，因此不能发生自我迁移。
3.1.2质粒载体的必备条件
一般没有经过体外修饰改造的质粒称为天然质粒。常见可用于基因
工程的天然质粒载体有pSC101、ColE1等。直接采用天然质粒用做载体
存在一些缺陷，因此限制了它在基因工程中的使用。最早用于基因克隆
的天然质粒是pSC101，其大小为9.09kb，是一个严紧型质粒。每个宿主
细胞中仅有1～2个拷贝，具有多个限制性核酸内切酶的单一酶切位点，但pSC101只有一个选择性标记Tetr，不能使用插入失活技术筛选重组
子。此外，pSC101的相对分子质量较大，克隆外源DNA的能力有限，拷贝数低，使得分离提取质粒DNA的工作难度大。
另一个天然质粒载体是ColE1，它的唯一单酶切位点EcoRⅠ位于大
肠杆菌素E1的编码基因内，插入外源基因后，引起插入失活，不能合成
大肠杆菌素E1，因此可以根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择重组子。
但ColE1的克隆位点有限，并且大肠杆菌素E1的免疫筛选，在实际应用
上比较麻烦。
一种理想的质粒载体一般应具备以下条件：
①具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数；
②具有多个单一的限制性核酸内切酶的酶切位点。基因工程中所使
用的载体一般有一个多克隆位点(multiple cloning site，MCS)。所谓
多克隆位点(或称多接头)，是指载体上人工合成的含有紧密排列的多
种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。它提供了各种各样可单独
或联合使用的克隆靶位点，以便克隆由多种限制性核酸内切酶中任意一
种或几种酶切割后产生的DNA片段。
③具有两种以上的选择标记基因。
④具有安全性。缺失mob基因后质粒就不会从一个细胞转移到另一个细胞中，减少了基因工程体扩散的危险性。
3.1.3常用的质粒载体类型
目前常用的克隆质粒载体有pBR322、pUC及其派生质粒载体。
pBR322质粒及其派生质粒具有较小的相对分子质量，可以克隆大到6kb
的外源DNA片段，具有两种选择标记，可利用氨苄青霉素和四环素来筛
选重组体，具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点，其中hindⅢ、BamhⅠ、SalⅠ、EcoRⅤ、SphⅠ的酶切位点位于Tetr中，pstⅠ的酶切
位点位于Ampr中，在这些位点克隆外源基因可利用插入失活法筛选重
组体。在宿主细胞内具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素处理扩增后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。
pUC系列的质粒载体通常是成对构建的，如pUC18pUC19，两者
的差别仅在于多克隆位点的方向相反。pUC系列的质粒载体除含有克隆
载体的一般元件以外，还包括大肠杆菌乳糖操纵子的β半乳糖苷酶基因
(lacZ)的启动子和β半乳糖苷酶氨基端头146个氨基酸片段的编码序
列，此结构特称为lacZ′基因，表达产生α肽；当无外源基因片段插入
时，质粒表达的α肽可与宿主菌上表达的β半乳糖苷酶的C端片段融为一
体，形成具有酶学活性的β半乳糖苷酶，产生lacZ+表型，实现了基因内
互补，这种互补现象叫做α互补。
具有酶学活性的β半乳糖苷酶在诱导物异丙基βD硫代半乳糖苷
(IpTG)存在时，可以将生色底物5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(Xgal)分
解，形成蓝色产物，在平板上形成蓝色的菌落。当多克隆位点中插入外
源DNA片段时，α互补作用遭到破坏，在含有IpTG和Xgal的平板上将出
现白色菌落。这种方法又称α筛选。当然，当插入的DNA片段较小，不
破坏α肽的读码框时，重组子菌落可表现出浅蓝色。
在pBR322基础上构建的pUC质粒载体，仅保留了氨苄青霉素抗性
基因和复制起点，相对分子质量更小，如pUC8pUC9为2750bp，pUC18pUC19为2686bp，而且利用组织化学法筛选重组体，更方便省
时。因此，pUC系列质粒是目前最广泛使用的质粒载体。
pGEM系列质粒载体就是一类多功能载体，如pGEM3、pGEM4、pGEM3Z、pGEM4Z、pSp64、pSp65、pGEM3Zf等，都是由pUC系列质
粒载体派生而来的，含有T7及Sp6RNA聚合酶的启动子及转录起始位
点，它们分别位于lacZ′基因中多克隆位点的两侧，故在体外能转录出相
应的mRNA。因为该质粒还具有Lac启动子调控区及α肽编码区，噬菌体
F1的复制起始区以及正、反向序列分析引物的结合位点，所以能进行测
序操作。
pBV221表达载体是我国科学家构建的胞内表达载体，其表达产物
位于细胞质中。它利用λ噬菌体的pL、pR作为串联启动子，一个温度敏感的转录阻遏蛋白基因cI857位于其上游；在多克隆位点的下游区有一
强转录终止序列rrnB；在多克隆位点与启动子之间有SD序列。cI857阻
遏蛋白是一个温度敏感的转录调控蛋白，在30℃时其与启动子紧密结
合，阻止转录起始；当培养温度升到42℃时，阳遏蛋白失活并从启动子
上解离，RNA聚合酶与启动子结合而起始转录，这种可诱导的启动子使
得基因能高效表达。
pTA1529是分泌型表达载体，在启动子之后有一信号肽编码序列。
外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点，使外源基因的第一个密码子
正好与信号肽最后一个密码子相接。外源基因连同信号肽基因一起转
录，然后翻译成带有信号肽的外源蛋白。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌
细胞膜与细胞外壁之间的周质时，信号肽被信号肽酶所切割，得到成熟
的外源蛋白。pTA1529由大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因启动子(phoA)及
其信号肽(由21个氨基酸组成)基因构建而成。在磷酸盐饥饿的状态
下，外源蛋白得以表达并分泌到细胞周质中。大肠杆菌中常用介导分泌
的信号肽除phoA的信号肽外，还有大肠杆菌外膜蛋白(Omp)类的信
号肽等。
根据复制模式，可将酵母的质粒分成5种不同的类型：YIp、YRp、YCp、YEp和YLp。其中，除了线性质粒YLp之外，全能与大肠杆菌质
粒构成穿梭载体。在动物体系中也已经发展出类似的穿梭质粒载体，最
早是由大肠杆菌质粒载体和牛乳头状瘤病毒(bovine papilloma virus，BpV)构建而成的。例如，pBpVBV1就是一种典型的动物细胞系统穿梭
质粒载体，它既可在大肠杆菌细胞中复制，亦可在动物细胞中复制。但
是，目前还没有发展出适用的大肠杆菌植物细胞穿梭质粒载体。第7章 λ噬菌体载体
细菌质粒载体为基因克隆提供了方便，但是其克隆容量仅在10kb左
右，不能满足诸如构建基因组文库等的要求。因为需要找到一种克隆容
量更大的载体，λ噬菌体载体便应运而生。
3.2.1λ噬菌体的生物学特性
λ噬菌体由一个包裹着DNA的正二十面体的蛋白质头部和一个中空
管状的蛋白质尾部组成，属温和噬菌体。当它感染大肠杆菌时，尾部吸
附在大肠杆菌细胞壁上，头部中的DNA经尾部注入到细菌细胞中，蛋白
质外壳留在细菌细胞外面。噬菌体DNA进入细菌细胞内后，可有溶菌周
期和溶原性周期两种生活周期。在溶菌周期中，λ噬菌体的DNA分子便
可借助宿主的复制和转录系统进行复制和外壳蛋白合成，同时两者组装
成完整的噬菌体颗粒，20min后就可使宿主细胞发生裂解，释放出大约
100个噬菌体颗粒。在溶原性周期中，λ噬菌体的DNA分子并不马上复
制，而是在特定的位点整合到宿主染色体DNA中，与宿主染色体形成一
体，并随宿主染色体的复制而复制，随宿主的分裂繁殖而传给其子代细
胞。但这种潜伏的λ噬菌体DNA在某种营养条件或环境条件胁迫下，可
以从宿主染色体DNA上切割出来，并进入溶菌周期。
λ噬菌体基因组是一条线性双链DNA分子，大小为48502bp，其上有
12个碱基的单链互补黏性末端，当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过
黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双
链区段称为cos位点(cohesiveend site)。这是将λDNA包装到噬菌体
颗粒中所必需的DNA序列。
λ噬菌体基因组分为3个区域：
①左侧区，自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。
②中间区，介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬
菌斑形成无关，被外源DNA片段取代后，并不影响噬菌体的生命活动。
中间区包含重组基因和一整合切割基因。
③右侧区，位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基
因和裂解基因。
在裂解周期的早期，环状的λDNA分子按θ型进行双向复制，到了晚
期，控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变成滚环型复制，合
成出由一系列λDNA线性排列的多聚体分子。线性的λDNA多聚体分子
不能被包装进头部，必须经过核酸酶的切割作用，从cos位点将它分成
单位长度的单体分子，才能够被包装起来。cos位点是λ噬菌体正确包装
的必需位点。
在溶原性周期，λDNA稳定地整合到宿主染色体上并随之一起复制。在进行这种复制时，只有CI基因得以表达，合成出一种可以使参与
溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。
3.2.2常见的λ噬菌体载体的构建
野生型的λ噬菌体DNA基因组大而复杂，不适于直接用作基因克隆
的载体，而且λ噬菌体外壳只能接纳一定长度(即相当于野生型λ基因组
大小的75%～105%)的DNA分子。因此必须对野生型λDNA进行改
造。
根据理想基因工程载体的条件，并针对野生型λ噬菌体作为基因工
程载体的缺陷，对λDNA进行了以下几方面的改造：
①切除掉λDNA的非必需区段，扩充λ噬菌体载体的克隆容量；
②除去λDNA必需区段中的限制性核酸内切酶识别位点，在非必需
区引入合适的限制性核酸内切酶位点；
③引入适当的选择性标记以方便重组子的筛选；
④通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于
生物学防护等。
早期构建的λ噬菌体载体有插入型和取代型两种不同的类型：只具
有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生
载体，称为插入型载体，如λgt10、λgt11、λBV2、λNM540、λNM1590、λNM607等。具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们
之间的DNA区段可被外源DNA片段所取代，这类λ噬菌体派生载体称为
取代型载体(或称置换型载体)，如Charon4、Charon10、Charon35、λgtWES、λEMBL3等。这两种载体特点不同，用途也不尽相同。插入型
载体只能承载较小的外源DNA片段，一般在10kb以内，广泛应用于
cDNA及小片段DNA的克隆；对于取代型载体，除去中间填充片段，其
左右两臂通过融合所形成的基因组如果太短，就无法包装成有侵染力的
噬菌体；只有当一定大小的外源DNA片段插入之后，才能包装成有侵染
力的噬菌体，并形成噬菌斑。由此可见，这种载体对重组噬菌体有正向
选择作用。
取代型载体可承载20kb左右的外源DNA片段，常用来克隆高等真核
生物的染色体DNA。随着多克隆位点技术的应用，现在常规使用的λ噬
菌体载体都带有多克隆位点，其中许多既可用作插入型又可用作取代
型。
3.2.3常见的λ噬菌体载体
在λ噬菌体载体的非必需区段插入LacZ′基因，其中带有多克隆位
点，如λgt11、λgt18~23等，它们在生色底物(Xgal)和诱导物(IpTG)
存在时，与相应的Lac—宿主通过α互补作用在平板上可形成深蓝色噬菌
斑。如果β半乳糖苷酶基因被外源DNA片段插入失活，所产生的重组噬菌体丧失α互补能力，则在含有Xgal和IpTG的平板上形成无色噬菌斑。
因此，对于这类λ噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛
选。这类载体有λgt11、λgt18~23、Charon2等，都含有lacZ′基因，其上
具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点，可用组织化学法筛选重组
体。
噬菌体434是λ噬菌体家族的成员之一，它的免疫区段(imm434)
具有EcoRⅠ和hindⅢ两种限制性核酸内切酶的单切位点，当由这些位点
插入外源DNA片段时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到
破坏。因此，凡带有外源DNA片段的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而
没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，所以不同的噬菌斑形态
可作为筛选重组体的标志。科学工作者通过噬菌体杂交的办法，已经将
imm434免疫区段导入λ噬菌体基因组，构建成许多免疫功能失活的插入
型载体。这类常用的载体有λgt10、λNM1149及Charon6、Charon7等，可根据噬菌斑的形态筛选重组体。
Charon系列取代型载体专门设计用来克隆大片段DNA，常用的有
Charon32～35、Charon40、Charon21A等。Charon34的中间填充片段为
16.4kb的大肠杆菌DNA的BamhⅠ片段，Charon35的中间填充片段为
15.6kb的大肠杆菌DNA的BamhⅠ片段，它们在填充片段的两侧都有一
个反向的多克隆位点。
λEMBL系列取代型载体也是用来克隆DNA大片段的，常用的载体
有λEMBL3、λEMBL4、λEMBL3A等。λEMBL4的中间填充片段为
13.2kb，其两侧为限制性核酸内切酶的单切位点。λEMBL3A是在
λEMBL3的基础上使A基因发生琥珀突变而构建的。第8章 单链DNA噬菌体载体
单链DNA噬菌体载体主要是由M13噬菌体构建发展起来的一类载
体。它们具有其他载体所不具备的优越性：
①它们不存在包装限制问题，已成功地包装了总长度为M13DNA6
倍的DNA分子，能克隆较大的DNA片段。
②可从噬菌体颗粒中产生大量含有外源DNA序列的单链DNA分
子。这种重组体单链DNA分子在基因定点突变、DNA序列测定、杂交
探针制备中特别有用。
③应用这类载体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入方向。
④可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA，如同质粒一样，能在体
外进行基因克隆操作。⑤其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大
肠杆菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。因此，它们在基因工程中
具有特别重要的作用，越来越受到人们的重视。
3.3.1M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体含有一个6.4kb的单链闭环DNA分子，外形呈丝状，大
小为900nm×9nm，这条感染性的单链DNA称为M13噬菌体的正链
DNA[(+)DNA]。M13噬菌体基因组的90%以上是编码蛋白质基
因，M13噬菌体并不像λ噬菌体那样存在插入外源DNA的非必需区域。
M13噬菌体在感染大肠杆菌时通过性纤毛进入宿主细胞内，故其只
能感染大肠杆菌雄性菌株。M13噬菌体的繁殖并不会导致宿主细胞发生
溶菌现象，感染的细胞能够继续生长和分裂，一般认为，M13噬菌体首
先吸附在性纤毛的末端，然后外壳蛋白脱落，(+)DNA在附于其上的
基因Ⅲ编码蛋白的引导下，进入大肠杆菌细胞内。在宿主细胞内复制酶
的作用下，以(+)DNA为模板，合成其互补的(—)DNA，形成双链
DNA，称为复制型DNA(replication form DNA，RFDNA)，它按θ形式
进行DNA复制。当在宿主细胞内积累约200个RFDNA分子后，M13噬菌
体的基因Ⅱ产物便在RFDNA的正链特定位点上作用，产生一个切口，正式开始M13基因组的复制。其基本特点是利用大肠杆菌DNA聚合酶
Ⅰ，以(—)DNA为模板按滚环方式合成(+)DNA，复制叉每环绕负
链整整一周时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切除下去，经环化后形成单
位长度的M13噬菌体基因组DNA。这种滚环复制是不对称的，因为基因
Ⅴ编码的单链特异结合蛋白，与(+)DNA结合，阻断(—)DNA的合
成。新产生的游离(+)DNA按一种特异方式包装成噬菌体颗粒。这时
与基因Ⅴ产物形成DNA蛋白质复合物的(+)DNA转移到细胞膜上，同
时基因Ⅴ蛋白从(+)DNA上脱落下来，(+)DNA从宿主细胞膜上溢
出，并在此过程中被外壳蛋白质包装成噬菌体颗粒。这种包装方式不需要预先形成固定结构，被包装的单链DNA大小不像λ噬菌体那样有严格
的限制，因此M13噬菌体载体具有较大克隆能力。
3.3.2常见的M13噬菌体载体
大多数M13噬菌体载体都是成对构建的，例如M13mp8
M13mp9、M13mp10M13mp11、M13mp18M13mp19等，它们之间
的区别在于相同的多克隆位点取向相反。M13mp1是构建的第一个M13
噬菌体载体，随后构建的一系列M13载体都是在此基础上经改建派生出
来的。例如M13mp2、M13mp3、M13mp7～11及M13mp18和M13mp19
等，其中M13mp18和M13mp19是目前最常用的M13噬菌体载体。
M13mp8～11及M13mp18和M13mp19等的多克隆位点是非对称排列
的，对某一限制性核酸内切酶只有单一酶切位点。因此，可用来克隆具
有不同限制末端的外源DNA片段，而且克隆片段插入的方向是固定的。
M13噬菌体载体的主要用途：第一，可以制备单链DNA进行DNA
序列分析，例如可以用一个引物(通用引物)，从两个相反的方向，同
时测定同一个外源DNA片段双链的核苷酸顺序，获得彼此重叠又相互印
证的DNA序列结构资料。第二，可以制备只与外源DNA的任意一条链
互补的DNA探针。第三，可以在寡核苷酸介导的基因定点突变中用来制
备含有目的基因的单链DNA模板。
M13噬菌体载体也存在不足，插入的外源DNA片段不稳定，片段越
大，越容易发生缺失或重排。一般情况下其有效的最大克隆能力仅
1.5kb。理论上，M13噬菌体载体克隆外源DNA片段有两种插入方向，但实际上外源DNA总是按一种主要的方向插入的。
3.4噬菌粒载体
噬菌粒载体(phagemid vector，phasmid vector)集质粒和丝状噬菌
体载体的长处于一体，具有很大的优越性：
①分子较小，约为3kb，可克隆10kb的外源DNA片段。
②由于它们既具有质粒的复制起始点，又具有M13噬菌体的复制起
点，因此在宿主细胞内可按质粒双链DNA分子形式复制，形成的双链
DNA既稳定又高产。当辅助噬菌体存在时，复制按M13噬菌体的滚环复
制模型进行复制，产生单链DNA分子。
③具有多种功能，用一个噬菌粒载体可以进行多种多样的工作，例
如，外源DNA片段的克隆、产生单链模板DNA用于基因定点突变、直
接测定插入的外源DNA片段的序列、对外源基因进行体外转录和翻译
等。
pUC118和pUC119噬菌粒载体是把含有M13噬菌体复制起点的476bp
长的片段分别插入到pUC18和pUC19质粒载体的NdeⅠ位点上构建而成
的。除了多克隆位点的取向相反外，两者的分子结构完全一样，都含有Ampr选择标记和乳糖操纵子的调控序列及α肽编码区，因此，可利用氨
苄青霉素和组织化学法筛选重组子。此外，在多克隆位点的两侧具有T7
噬菌体RNA聚合酶启动子，可进行体外转录。
3.5黏粒载体
λ噬菌体载体克隆外源DNA的能力，虽然理论上的极限值可达
24kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。而许多真核基因的
大小比通常预期的要大得多，有的可达35～45kb，甚至更大。因此，为
了克隆和增殖真核基因组DNA大片段，科学工作者设计并构建了一类具
有较大克隆能力的新型克隆载体——黏粒载体(cosmid vector)，又称
柯斯质粒载体。黏粒载体是一类含有λ噬菌体的COS序列的质粒载体。
3.5.1黏粒载体的基本特点
1.具有λ噬菌体的体外包装、高效感染等特性
黏粒载体本身不能在体外被包装成噬菌体颗粒，只有在克隆了合适
长度的外源DNA片段后才能被包装成噬菌体颗粒，因此，它具有正选择
重组子的作用。这种噬菌体颗粒可以高效感染对λ噬菌体敏感的大肠杆
菌细胞。黏粒载体的重组子DNA分子进入宿主细胞后，便按照λ噬菌体
同样的方式环化起来。但黏粒载体并不含有λ噬菌体的全部必需基因，因此它不能够形成子代噬菌体颗粒。
2.具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性
黏粒载体具有质粒的复制起点，在宿主细胞内像质粒DNA一样进行
复制，并且在氯霉素作用下可进一步扩增。黏粒载体通常具有抗菌素抗
性选择标记，其中有一些还带有引起插入失活的克隆位点。此外，黏粒
载体的相对分子质量较小，易于克隆操作。
3.具有高容量的克隆能力
黏粒载体的分子较小，一般为5～10kb。按λ噬菌体的包装限制(38
～52kb)，黏粒载体的平均最大克隆容量约为42kb(28～50kb)，平均
最低克隆容量约为33kb(11～34kb)。由此可见，黏粒载体用于克隆
DNA大片段特别有效。
4.具有与同源序列的质粒进行重组的能力
当黏粒载体与一种带有同源序列的质粒共存于同一个宿主细胞中
时，它们之间便会通过同源重组形成共合体。
3.5.2黏粒载体的构建
应用黏粒载体构建基因组文库所遇到的最大问题是黏粒载体经过酶
切产生的线性DNA片段彼此之间会首尾相连形成多聚体分子；其次是酶
切的基因组DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片
段随机再连接，串联地插入到载体上，而它们的结合顺序并不符合在真
核基因中的固有排列顺序。因此，使用含有这种插入片段的克隆作DNA序列分析，所得出的染色体结构将是错误的。除了用克隆方法解决此问
题外，还通过对黏粒载体进行改良，设计并构建了一些新颖的黏粒载体
来解决此问题。例如，使用仅含有一个cos位点的黏粒载体进行克隆实
验，需要经过碱性磷酸酶的脱磷酸处理和凝胶电泳纯化等烦琐的操作程
序，其结果使得载体双臂DNA的最终获得率极低，为此，Bates和
Swift(1983)构建了一种具有两个cos位点的黏粒载体——c2XB。这个
载体具有BamhⅠ单克隆位点，产生平头末端的SmaⅠ限制性核酸内切酶
的酶切位点位于两个cos位点之间。因此，载体经双酶切后，得到中间
具有一个cos位点、两端分别为平头末端(SmaⅠ)和黏性末端
(BamhⅠ)的载体双臂DNA片段，这样有效地阻止了载体双臂DNA片
段自我连接形成多聚体分子，从而提高了克隆效率，降低了假阳性的比
例。
3.5.3黏粒载体在基因克隆中的应用
应用黏粒载体克隆真核基因组DNA大片段的技术，称为黏粒克隆
(cosmid cloning)。它的一般程序是：先用特定的限制性核酸内切酶局
部消化真核生物的DNA，产生出高相对分子质量的外源DNA片段，与
经同样的限制性核酸内切酶切割过的黏粒载体线性DNA分子进行体外连
接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一
个cos位点、中间为长度40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点
在取向上是一样的。这种分子与在λ噬菌体感染晚期所产生的分子是类
似的。因此，当加入λ噬菌体的包装连接物时，它将能识别并切割这种
两端各由一个cos位点包围着的35~45kb长的真核DNA片段的重组分子，并把这些分子包装进λ噬菌体的头部。当然，由包装形成的含有这种
DNA片段的λ噬菌体头部是不能够作为噬菌体生存的，但它们可以用来
感染大肠杆菌。感染之后，注入细胞内的这种重组分子便通过cos位点
环化起来，并按质粒分子的方式进行复制和表达其抗药性选择标记。
黏粒克隆存在技术上的两大缺陷。为此，一般都在连接反应之前，先用碱性磷酸酶对线性的黏粒载体DNA做预处理，使之脱磷酸，以阻止
它们之间发生自我连接作用。另一比较有效的办法是，在进行连接反应
之前，先将局部消化产物通过凝胶电泳做大小分级分离，然后将长度在
31~45kb范围的DNA片段再与线性化的黏粒载体DNA进行连接。然而，即使经过了这样的处理，在实际的黏粒克隆中，也依然会出现一些由原
来彼此不相邻的两条DNA片段连接形成的串联插入。因此，人们从克隆
方法和构建的一些新颖的黏粒载体的基础上，设计了特殊的克隆方案，解决了黏粒克隆中存在的技术难点。
3.5.4常用的黏粒载体及应用
在基因工程中常用的黏粒载体有：pJt38、c2XB、phC79、pcosEMBL、pWE15、pWE16、Charomid系列等。pJB8这个黏粒载体的
最大特点是在克隆位点BamhⅠ的两侧，各有一个EcoRⅠ酶切位点，因
此，可用EcoRⅠ切割，从重组体分子中重新获得插入的DNA片段，它
带有氨苄青霉素抗性选择标记，其克隆能力为31~47kb。
黏粒载体的主要优点是克隆容量大，转化率高。因此，它主要用于
真核生物的基因组文库构建。这样，不仅可以减少基因组文库的克隆
数，大大减少工作量，而且可以提高筛选时阳性克隆的检出率(包装正
选择等)。尽管黏粒克隆的技术困难已基本得到解决，但由于λ噬菌体
载体具有多功能性和较高的克隆效率，因此，λ噬菌体载体仍然是目前
构建基因组文库时首选的克隆载体。黏粒载体只有在以下两种特定的情
况下使用：
①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；
②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段。总之，在克隆大
容量目的基因时使用黏粒载体具有明显的优势。第9章 人工染色体
3.6.1酵母人工染色体
由于许多真核基因过于庞大，特别是人类基因组计划、水稻基因组
计划需要能克隆更长DNA片段的载体，于是一系列人工染色体
(artificial chromosome)应研究需要而产生。酵母人工染色体(YAC)
是目前能克隆最大DNA片段的载体，可插入100～2000kb的外源DNA片
段。YAC是由酵母的自主复制序列(autonomously replicating
sequence，ARS)、着丝粒(centromere，CEN)、四膜虫的端粒
(telomere，TEL)以及酵母选择性标记组成的能自我复制的酵母线性
克隆载体。着丝粒主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到各子细胞
中；端粒位于染色体末端，对于染色体的稳定及端粒复制具有重要意
义；自主复制序列即染色体上DNA复制的起始位点。首先构建两臂，左
臂含有端粒、酵母筛选标记Trpl、自主复制序列ARS和着丝粒，右臂含
有酵母筛选标记Ura3和端粒，然后在两臂之间插入DNA大片段，从而构
建成酵母人工染色体。
YAC虽然可容纳较长的DNA片段，但是用其克隆外源基因易出现
嵌合体和不稳定现象，而且YAC克隆不容易与酵母自身染色体
(15Mb)相分离。
3.6.2细菌人工染色体
细菌人工染色体(BAC)是以细菌F因子(细菌的性质粒)为基础
构建的细菌克隆载体。BAC除去了F因子的转移区及整合区等复制非必
需区段，并引入多克隆位点及选择标记。BAC克隆容量可以达300kb，重组DNA比较稳定，比YAC易分离，但是拷贝数低。
3.6.3哺乳动物人工染色体
如果能从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒，就
可以构建成哺乳动物人工染色体(MAC)，它可以克隆大于1000kb的
外源DNA片断。MAC有广泛的应用领域，可以研究哺乳类细胞中染色
体的功能。MAC也可以用于体细胞基因治疗，原因是由于MAC能在宿
主细胞中自主复制，可以将整套的基因，甚至将有一串与特定遗传病有
关的基因及其表达调控序列转入受体细胞中，不会将DNA插入到病人基
因组而引起插入突变，使基因治疗变得更有效。
3.7植物基因工程载体
理想的植物基因工程载体要求其相对分子质量不能太大，能携带外
源DNA进入植物细胞并整合到基因组中，插入较大的外源DNA片段而
不影响其复制和转化细胞的能力；具有选择标记，能有效地筛选转基因
植株等特点。3.7.1质粒转化载体
Ti质粒是从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中分离出来的
一种肿瘤诱导质粒。Ri质粒是从发根农杆菌(Agrobacterium
rhizogenes)中分离出来的一种毛状根诱导基因。根癌农杆菌和发根农
杆菌是两种宿主非常广泛的土壤细菌，在自然状态下它们能通过伤口侵
染植物，分别导致冠瘿瘤和毛状根的发生。Ti质粒和Ri质粒上含有
TDNA区段，TDNA能够高频率插入植物基因组中。将外源基因插入到
TDNA中，外源基因可以随着TDNA整合到植物基因组中从而实现基因
的转移。因此，Ti质粒和Ri质粒是植物基因工程最理想的转化载体。
3.7.2植物病毒转化载体
植物病毒种类繁多，在已知的300多种植物病毒中有大约91%为单
链RNA病毒。病毒侵染植物细胞后，病毒的DNA或RNA能自发地进行
基因转移，并且在植物细胞中复制和表达。因此，植物病毒可以作为植
物的基因转化载体。
迄今为止所知的双链DNA病毒只有花椰菜花叶病毒组和黄瓜黄脉病
毒组。其中花椰菜花叶病毒(CaMV)的性质、功能、基因组结构是研
究得轻清楚的，被认为是病毒转化载体的最佳候选者。
花椰菜花叶病毒(CaMV)是一种双链DNA病毒，目前发现12bp的
外源小片段可以在CaMV的四个区域插入：编码区Ⅱ，也称基因Ⅱ或
OrfⅡ；编码区Ⅰ和Ⅵ之间的大间隔区；编码区Ⅳ的C末端区域和编码区
Ⅵ区域。研究发现，当插入500bp的较大片段时，大部分CaMV就丢失
了DNA,从CaMV的插入外源DNA限制来看，这种植物基因转化载体还
需要进一步改进。
单链DNA病毒又称为双联体病毒或孪生病毒(GeNV)，感染范围
较广，包括双子叶植物和单子叶植物，其传播媒介是昆虫。该病毒由两
个连接在一起的病毒颗粒组成，其大小18～20nm，含有1～2个长为2.5
～3.0kb的单链环状DNA分子。例如菜豆金花叶病毒(BGMV)、番茄
金花叶病毒(TGMY)含有感染所必需的两个单链环状DNA分子，小麦
矮化病毒(WDV)含有一个单链环状DNA分子。
在双子叶植物中，TGMV的衣壳蛋白基因被NptⅡ和Cat取代，并得
到复制和表达，进一步说明GeNV是一种很有前景的转化载体。
烟草脆裂病毒(TRV)是一种单链RNA病毒，TRV基因组由两段独
立的RNA组成，每一段都包装成棒状的病毒颗粒。其中较长的一段
RNA因为不含有衣壳蛋白的编码序列，所以单独存在时只能产生不包装
RNA分子。较短的RNA编码衣壳蛋白，但其复制必须有较长RNA的存
在才能进行。利用这两种病毒颗粒共同感染植物，可以使病毒基因组得
到正常的复制和表达。一般认为，利用RNA病毒作为转化载体首先单链的病毒RNA在反转录酶的作用下反转录成一条单链的cDNA，然后单链
cDNA在DNA聚合酶的作用下形成双链cDNA，通过重组技术cDNA双链
插入到克隆质粒中，使在克隆质粒中的病毒cDNA连同外源基因先转录
成RNA转录体，再用此来感染植物。
3.8动物基因工程载体
将外源基因转入动物细胞，通常应用由动物病毒构建的一类载体。
病毒具备异常有效的入侵细胞的能力，因此它是功能强大的基因转移载
体。例如SV40病毒载体、杆状病毒载体在动物基因工程中已愈来愈普
遍地应用。但是在构建病毒载体时，因为病毒本身的致病性，所以往往
利用致病力弱的动物病毒或某些病毒的弱毒株进行改造，构建成基因载
体。
动物病毒侵入动物细胞后，呈现裂解感染和整合性感染两种生长状
态。裂解感染是依靠宿主细胞的酶和调控系统合成病毒核酸和结构蛋
白，病毒DNA大量复制，在感染的细胞内有着大量的病毒DNA拷贝，病毒在细胞内装配成完整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，感染细胞则大多数因代谢障碍而死亡。整合性感染是病毒核酸整合到细
胞染色体中，随着细胞DNA的复制而扩增。病毒DNA的序列中往往具
有几个很强的启动子，它可使排列在其后方的基因高效表达。如果将外
源基因插入在病毒DNA强启动子的后方，那么随病毒DNA在细胞内大
量复制的同时，也将得到外源基因的高效表达。
3.8.1SV40病毒载体
SV40是一种猿猴空泡病毒，环状双链DNA分子，全长5241bp。根
据基因组内转录的时间顺序和方向，分为两个转录区域，即早期转录区
和晚期转录区。当它感染猿猴细胞时，其DNA进入细胞核后，开始依次
进行早期转录、DNA复制、晚期转录。在早期转录中产生T抗原和t抗
原。当细胞内T抗原和t抗原积累到足够时，T抗原启动DNA复制，并启
动顺时针方向的转录。在晚期转录中，产生病毒外壳蛋白Vp1、Vp2、Vp3，并与新复制的病毒DNA装配成病毒颗粒，细胞内病毒颗粒达到
105个时，细胞破裂，释放出病毒颗粒。此过程称为裂解感染，这种敏
感细胞称为受纳细胞。当SV40感染啮齿动物细胞时，DNA整合到宿主
细胞的染色体DNA上，随染色体DNA复制而复制，不会使细胞破裂，最终导致细胞癌变，不产生病毒颗粒，这个过程称为非裂解感染，这类
细胞是非受纳细胞。SV40致瘤的原因主要是其基因组整合入宿主基因
组，可以整合病毒基因组的某些片段，也可以整合10拷贝以上的病毒基
因组；但至今人们对整合机制还不清楚。
SV40病毒基因组中，早期区域和晚期区域是相对独立的转录单
元，因此可以有晚期区被取代和早期区被取代两种类型的取代型载体。SV40颗粒包装对分子大小有严格限制，构建载体只能是取代型的，被
取代的DNA不能超过基因组全长的30%。
对于晚期区取代型载体，由于缺失晚期区域，不能将重组DNA包装
成新的病毒颗粒，因此这样的克隆载体必须与辅助病毒一起感染受体细
胞。辅助病毒是一种不产生T抗原，但能产生外壳蛋白的突变体。在受
体细胞内，依赖辅助病毒产生的外壳蛋白，重组DNA包装进新的病毒颗
粒。
对于早期转录区取代型载体，由于缺失早期区域，不能产生T抗
原，缺失复制功能，必须具有T抗原互补功能的辅助病毒，或者建立含
SV40早期转录区的辅助细胞系(如COS、hFS细胞系)。一般用后者把
SV40早期转录区DNA序列整合到敏感动物细胞基因组中，使其有效表
达T抗原。当早期区DNA序列被外源DNA取代的重组SV40DNA导入这
种细胞时，T抗原得到互补，重组SV40DNA能进行有效复制。
3.8.2反转录病毒载体
反转录病毒又称逆转录病毒，是一类RNA病毒。该类病毒大多数具
有致瘤性，故又称为RNA肿瘤病毒。其基因组RNA进入宿主细胞后通
过自身编码的反转录酶合成双链DNA，这种DNA能随机整合到宿主细
胞基因组中，随宿主细胞基因组一起复制或转录，转录产生的正链RNA
可以装配成病毒颗粒，也可以不发生装配，成为病毒蛋白合成的模板。
反转录病毒的基因组为两条相同的单链RNA组成的二聚体，通常长
为8～10kb，其两端含有相同的结构，即长末端重复序列(long terminal
repeat，LTR)，其长度为几百个碱基。逆转录病毒能在宿主细胞中永
久性地表达外源基因，具有构建载体的良好特性。此外，它能感染几乎
所有类型的细胞，受体细胞的范围广泛。
反转录病毒载体的类型，早期构建的多为单基因载体，是以单个外
源基因取代反转录病毒的反式作用序列。由于这种载体的外源基因表达
只受LTR中病毒的唯一启动子调控，因而应用受到局限。后来构建的并
被广泛应用的是多基因载体，例如双表达载体、自灭活载体、自分解载
体等。双表达载体保留了大部分的病毒顺式作用序列。病毒载体携带2
个外源基因，均处于5′端LTR中启动子的控制下，这种载体的特点是提
供了病毒基因转移、表达的顺式作用序列，即5′端LTR中的启动子、增
强子、3′端LTR中的多聚A信号和内含子剪切位点。但是转移的基因只
在病毒启动子有活性的细胞中才能表达。自灭活载体通过缺失LTR中的
部分启动子和增强子，产生的自灭活载体在感染宿主细胞后形成的前病
毒DNA不能进行转录，外源基因由自身融合的启动子控制表达，因而不
会发生插入激活作用。此类载体的特点是比较安全，但不足之处是大多
数载体产生病毒感染的滴度较低，不能进行有效的基因转移。自分解载体含有反转录病毒的内部附着序列，病毒基因组的结构不完整，病毒复
制两次后前病毒DNA整合到宿主基因组中，外源基因的内部启动子控制
进行特异的表达。此种载体不能产生复制性病毒粒子，因而也是一种安
全的反转录病毒载体。
以反转录病毒作载体进行基因转移具有基因转移效率高、病毒感染
力强等优点，而且反转录病毒有广泛的宿主范围，不仅适用于单层细
胞，也适用于悬浮培养的淋巴细胞、前髓细胞及造血干细胞等多种骨髓
来源的细胞；经特殊构建的反转录病毒载体是缺陷型，不易产生感染性
病毒粒子，比较安全。不过，有的反转录病毒载体可能具有潜在激活癌
基因的作用。
3.8.3痘苗病毒载体
痘苗病毒的基因组是一个线性双链DNA，长约185kb，其中有一个
28kb的区域是病毒复制的非必需区，可以被外源基因取代。痘苗病毒能
在宿主的细胞质中独立地复制和转录，高度稳定，宿主范围广，因此，可以作为良好的载体。痘苗病毒载体的构建需要采用同源重组的方法。
重组痘苗病毒表达外源基因，需要在基因两端组装上胸腺嘧啶核苷激酶
的tk基因或ha基因同源重组，将外源基因整合到痘苗病毒基因组上。痘
苗病毒载体通常具有三个主要成分：痘苗病毒的调控序列、胸腺嘧啶核
苷激酶基因(tk基因)以及位于tk基因中供外源基因插入的克隆位点，利用tk基因插入失活作为选择标记。
痘苗病毒载体的主要用途是构建痘苗病毒活疫苗。迄今为止，用痘
苗病毒载体表达的外源基因有：乙型肝炎表面抗原基因、流感病毒血凝
素基因、狂犬病毒表面糖蛋白基因，以及单纯疱疹病毒、EB病毒、水
泡性口炎病毒、伪狂犬病毒和疟原虫等的抗原基因。
3.8.4腺病毒载体
腺病毒是一种二十面体的颗粒线状双链DNA病毒，其基因组大小为
32~36kb，分为哺乳动物和禽类两个属。在线性DNA两端各存在1个含
103~162bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，因此
变性后的两条链可能分开成单链，彼此形成一个茎环结构。ITR为病毒
DNA复制的起始位点。
野生型腺病毒容纳外源DNA的最大容量为2kb。如果将病毒的非必
要区域删去，用外源DNA取代，可以增加病毒接受外源DNA的容量，又不影响重组病毒的复制和包装。理论上，基因组除了两端各约500bp
的序列结构是复制和包装所必需的，其他部分均可以被外源DNA取代。
人腺病毒具有易感染性，宿主范围广，而且外源DNA不会整合到宿主染
色体上，具有较高的安全性，已成为较有前途的基因转移载体之一。
腺病毒载体在转移和表达外源基因方面具有许多优点：①其基因组较小，易于操作；②有多个外源基因插入位点；③腺病毒DNA不整合到
宿主染色体上，不会引起插入突变；④腺病毒致病性小，重组腺病毒结
构稳定；⑤重组病毒滴度高。
本章小结
基因工程载体是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载
工具”，它的本质是DNA复制子。作为基因工程载体必须具备3个基本条
件：
①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。
②具有合适的限制性核酸内切酶位点。
③具有合适的选择标记基因。使用最多的基因工程载体是质粒载体
和噬菌体载体。
质粒载体主要有克隆质粒载体、表达质粒载体、穿梭质粒载体等。
常用的克隆质粒载体是pBR322及pUC系列。噬菌体载体主要有λ噬菌体
载体和M13噬菌体载体。它们的克隆容量大于质粒载体，用于基因文库
的构建。插入型λ噬菌体载体的克隆容量小于取代型λ噬菌体载体，前者
只能克隆10kb以下的外源DNA片段，后者可克隆20kb左右的外源DNA
片段。M13噬菌体载体在制备单链DNA中有重要用途。黏粒载体是一类
含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体，它的克隆容量较大，一般为
35~45kb，主要用于真核基因文库的构建。但上述载体的克隆容量有
限，不能满足基因组计划的大片段DNA的克隆，因此，构建了一系列的
人工染色体。YAC的克隆容量为100~2000kb。BAC的克隆容量可达
300kb。利用植物病毒构建了病毒转化载体，但转移的外源基因不能整
合到植物基因组上，以游离拷贝的形式存在。动物基因工程载体主要来
自于动物病毒，用于基因高效表达和基因治疗的研究。相对于植物病毒
转化载体来说，动物病毒载体大多数都能将外源基因整合到宿主基因组
上，随宿主染色体的复制而遗传给后代，主要有SV40病毒载体、反转
录病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体等。第10章 核酸的提取与纯化
基因工程操作能够跨越天然物种屏障，把来自任何生物的基因插入
到新的宿主细胞中并扩增。在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载
体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先并无该类分子的细胞内
并持续稳定增殖和表达。基因工程的所有操作，基本上都依赖于核酸的
操作技术，也就是常说的基因操作的相关实验技术。
核酸在细胞中的含量很少，如核DNA，每个细胞中只有10—15~10
—10g。不同物种细胞核中DNA的平均含量变动很大，但同一物种不同
个体及个体的不同组织，其细胞核中DNA的含量是恒定的。RNA分子
较小，相对分子质量约为2.5×104~2×106。DNA分子很大，相对分子质
量约为106~1011。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有约5%存
在于线粒体、叶绿体等细胞器中，真核生物的RNA则75%左右存在于细
胞质中，约15%存在于细胞器中，约10%存在于细胞核中。原核生物的
DNA集中在核质区。RNA分散在细胞质里，细胞质中的RNA中，以
rRNA的数量最多，tRNA其次，mRNA最少。真核生物的染色体DNA是
双链线状，细胞器DNA、原核生物“染色体”DNA、质粒DNA是双链环
状的。多数生物体的RNA分子是单链线状的。病毒、类病毒所含的
DNA和RNA形式多样。
基因工程的主要操作对象就是核酸，所提取的核酸质量好坏就直接
关系到实验的成败。通常，细胞内的DNA包括基因组DNA和质粒DNA
两大类。基因组DNA的提取一般依据实验材料来选择合适的方法，相对
较为简单；而质粒DNA通常作为载体来进行转化，关系到转化的效率，所以显得尤为重要。
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、限制
性核酸多态性(RFLp)分析以及运用pCR技术分离目的基因等。利用基
因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮
团飘浮其中，可用玻棒将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附
于壁上及底部，从而达到提取DNA的目的。在提取过程中，染色体会发
生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温
和的条件下操作，尽量减少酚氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到
较长的DNA片段，如利用甲酰胺火棉胶袋法，可以得到200kb以上的
DNA片段。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以
上，否则酶切后很少有带合适末端的有效片段。而进行RFLp和pCR分
析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLp片
段(20kb以下)，并保证含有pCR扩增所需要的片段(一般2kb以下)。
不同生物(植物、动物和微生物)基因组DNA的提取方法有所不
同；不同种类或同一种类的不同组织其细胞结构及所含的组分不同，分
离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照相关文献和经
验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多
糖和酚类物质对随后的酶切、pCR等有较强的抑制作用，因此用富含这
类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
质粒DNA的分离方法很多，其依据是利用分子大小不同、碱基组成
的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常
用的有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂(如SDS)裂解法、羟基磷酸灰
石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。碱变性抽提法和煮沸法反应
比较剧烈，均可破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体DNA变性，而
共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕，两条链不会互相分离。当外界条件恢
复正常时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分
子，而较大的线性染色体DNA则难以复性，这两种方法适用于较小的质
粒。去污剂裂解法的条件则比较温和，一般用来分离大质粒(>
15kb)。以上方法均有利弊，有的难以控制，有的得率不高，有的手续
繁琐，还有的纯度不高，因此在制备质粒时，不但要考虑该质粒的特
性，还要考虑提取的质粒DNA的用量与用途，最终选择最佳的实验方
法。
有时所得的DNA纯度不符合进一步操作的需要，还需要进一步纯
化。质粒DNA纯化的方法都是利用质粒DNA相对较小和它的共价闭合
环状特性。常用的纯化方法有CsCl溴化乙锭梯度平衡离心和pEG差别沉
淀。前者可完全分离闭合环状DNA分子，适用于纯化易于产生切口的较
大的质粒(>15kb)。后者省钱省时，但不能有效地将质粒DNA的切口
环状分子与闭合环状分子分开。然而，这两种纯化方法都可得到足以胜
任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA。许多厂家根据离子交换、凝胶
过滤等方法的原理设计了各种商品层析柱，也可快速分离纯化微量的质
粒DNA。基因组DNA可用oligo(dT)纤维素、polyu琼脂糖柱层析、超
离心、分子杂交、电泳等方法纯化。
4.1.1核酸提取与纯化的基本原理
DNA是基因的物质载体，是基因操作的重点对象。在实际操作中主
要涉及两类DNA，其一是目的物种或细胞的基因组DNA，其二是克隆
载体和装载在载体中的克隆化基因。
在进行DNA抽提之前，需进行细胞破碎。细菌细胞有坚硬的细胞
壁，因此必须除去细胞壁才能把细胞内容物释放出来。细胞壁除去的方
法有：①机械法，如超声波、研磨法或匀浆法。
②化学试剂处理，即用EDTA和去离子剂SDS(十二烷基磺酸钠)
处理，EDTA能螯合二价离子，因而使细菌外膜不稳定，从而抑制了
DNase的活性，保护DNA不被降解，而去离子剂则具有溶解膜脂的作
用。
③酶解法，加入溶酶使细胞壁破碎。植物细胞也有细胞壁，但结构
与细菌不同，因此需要采用不同的方法处理，一般采用机械法或酶解法
处理。动物细胞没有细胞壁，因此只用温和的去离子剂溶解细胞膜即
可。
破碎的细胞或组织，去除了细胞壁或细胞质膜所得到的混合物中包
括DNA、RNA与蛋白质、脂肪和碳水化合物。由于细胞突然被裂解，会导致部分染色体断裂，特别是细菌染色体在自然状态下应该是环形
的，此时会有部分开环，变成线形。因此，如果要获得大片段染色体
DNA，温和的裂解条件是很重要的。
破碎细胞后，需采用不同的方法分离DNA、RNA或蛋白质，以获
得高纯度的核酸。
①去除DNA中的RNA。用RNase消化即可去除DNA中的RNA。
RNase是一种热稳定酶，能够除去痕量的DNase，否则DNase会降解
DNA。RNase在使用之前要加热。
②去除RNA中的DNA。去除RNA中的DNA要复杂得多，因为需要
无RNase活性的DNase。不过现在有商品化的无RNase活性的DNase，也
有无DNase活性的RNase。
③去除蛋白质。核蛋白常用蛋白水解酶消化，如蛋白酶K；也可用
高浓度的氯化钠溶液，在高盐溶液中，核蛋白易解聚，游离出DNA。
去除蛋白质是核酸提取至关重要的一步。由于细胞中含有大量降解
核酸的酶，某些蛋白会结合核酸从而干扰核酸提取过程。常见的去除蛋
白质的方法是酚氯仿法(酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1)，酚和氯仿皆
不溶于水。苯酚作为蛋白质的变性剂，可以抑制DNase的降解作用。当
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白质与DNA的联结作用已被蛋白酶K打
断，蛋白质分子表面又含有许多极性基团，与苯酚相似相容，所以蛋白
质分子溶于酚相，而DNA溶于水相。因此，当酚和氯仿加到细胞提取液
中分层，提取液经充分混合后，蛋白质会变性并沉积于中间层。
酚和氯仿都有变性蛋白质的作用，但酚的变性作用要大于氯仿。水
饱和酚的比重略大于水，在高浓度的盐溶液中，会有部分酚跑到水相
中，这不利于DNA的回收。加入氯仿后增加比重，使酚氯仿始终在下
层，方便水相的回收。此外，酚和水有一定程度的互溶性，如果单独用
酚抽提会有大量的酚溶到水相中，抑制后续的pCR操作。可以通过多次酚氯仿抽提来保证除去痕量的酚。酚是剧毒物质，操作时务必戴手套。
而异戊醇的作用仅仅是为了在离心时起消泡的作用，使水相与有机相更
加清晰，以便于水相的回收。
经过酚氯仿处理的匀浆液会分成三层，上层为水相，蛋白质位于中
间层，下层为有机相。经过酚氯仿抽提后，蛋白质被去除。但提取液中
的核酸浓度很低，而且还含有少量酚氯仿(酚可以部分溶解于水)，会
导致以后步骤(如pCR)中酶变性。最好的方法是沉淀核酸，如加入酒
精或异丙醇。当存在一价阳离子(Na+,K+,Nh+4)时，核酸被沉淀的同
时，一些盐也会被沉淀下来，可以用70%的酒精除去沉淀中的盐。
在抽提动物细胞核DNA时存在两个困难(高等植物与此类似)：
①从处死动物、分离组织器官到破碎细胞费时长，在此期间DNA可
能会被DNase降解；动物组织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易
破碎的肝、肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。
②动物细胞核的DNA相对分子质量大，一般比细菌的大2~3个数量
级，比病毒的大4~5个数量。因此对不同生物材料，要根据具体情况选
择适当的分离提取方法。
4.1.2植物细胞核DNA的提取
植物细胞DNA包括细胞核DNA、线粒体DNA与叶绿体DNA。对于
基因组文库的构建，常常需要高质量的细胞核DNA，为了保证文库的插
入片段大、基因组覆盖率高，抽提时常采取一些特殊的处理；而对于普
通用途的细胞核DNA的抽提相对简单。由于细胞壁及植物特有的细胞内
物质，从植物中分离高产量和高质量的DNA并不是一件容易的事，因此
需要用与动物及微生物不同的方法抽提。下面以水稻为例分别介绍这两
种用途的细胞核DNA的提取。
1.基因组文库构建所需细胞核DNA的抽提
取幼苗约30g，用液氮研磨成粉末后置于烧杯中，加入200mL预冷
的抽提缓冲液(10mmolL Tris·hCl ph9.5,10mmolL EDTA
ph8.0,100mmolL KCl,500mmolL蔗糖，4mmolL亚精胺，1mmolL精
胺，0.1%β巯基乙醇)，冰浴下充分匀浆，依次用150、200、400目的尼
龙筛网过滤并不断搅拌。在滤液中加入100mL含20%TritonX100的抽提
缓冲液，冰浴搅拌，按每管50mL分别装入离心管中，4℃1500g离心
10min，收集细胞核，用抽提缓冲液洗涤一遍。用1mL吸管头将核悬浮
并拌匀，45℃水浴中保温2min，加入12体积的1.5%低熔点琼脂糖，拌
匀后注入凝胶片模板并放于4℃冰箱促进凝固，制备好的琼脂糖凝胶块
用5倍体积裂解液(0.45molL EDTA,1%Sarkosyl,0.25mgmL蛋白酶K)
50℃轻轻摇动洗涤，50℃保温1～2天，用TE洗凝胶片3次，每次
20min。再用含1mmolL pMSF(phenylmethyl sulfonl fluoride，溶于异丙醇中)的TE在50℃保温1h。通过上述处理后，琼脂糖凝胶块中包含制
备好的超大片段基因组DNA。
高相对分子质量基因组DNA的制备是构建基因组文库的一大难关，关键是控制好细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量，包括细胞核的质量
和浓度、琼脂糖凝胶的浓度等。若细胞核在包埋之前破裂、细胞核浓度
太低、琼脂糖浓度过高等，都会造成失败。为了防止细胞核的破裂，用
于建库的组织始终在液氮中研磨且不能研磨得过细，做细胞核悬浮时动
作必须轻柔。包埋的琼脂糖浓度过高会影响酶切效果，甚至造成无法酶
切。研磨时液氮充分，大片段的操作除酶切外全部在4℃以下进行，这
样就有效防止了DNA的物理损伤和降解。选用绿色嫩叶为原材料，对粗
提的细胞核进行洗涤时，可以减少叶绿体的污染情况，纯净的细胞核是
浅黄色的，若颜色偏绿，可通过增加洗涤次数和降低离心速度来减少叶
绿体的污染。若在进行脉冲电泳分离后切下的片段太大，则连接效率就
太低，故切下大小为100～300kb的片段，连接效率高，产生的白色菌落
多，蓝色菌落很少。
2.非构建文库所使用的细胞核DNA的抽提
常采用CTAB法和SDS法来抽提植物基因物总DNA，抽提出来的
DNA基本上是细胞核DNA。CTAB法提出的DNA纯度较高，且能除去多
糖类物质，但如果所需要的DNA量不多，要求也不高，可使用SDS法微
量抽提。SDS法提取DNA时，只需要取新鲜叶片1g左右，用液氮研磨成
粉末，倒入2mL的离心管，加入800μL1.5%SDS微量抽提液，65℃水浴
30min，加入等体积的氯仿异戊醇乙醇(76∶4∶20)，混匀后，12000rmin离心8min，上清液转移到1.5mL离心管，加入等体积异丙醇
或2倍体积无水乙醇沉淀，12000rmin离心3min，弃上清，用0.5mL70%
的乙醇漂洗，风干，溶于50～100μL TE备用。
对于植物细胞核DNA的抽提，应根据实验目的选用不同的抽提方
法。另外，不同的植物材料，抽提的方法也略有不同，如果是植物材料
本身含糖量比较高，通常采用以下方法处理：
①在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：
100mmolL Tris·hCl(ph=8.0)、5mmolL EDTA和0.35molL Sorbitol洗
几次。
②使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35倍体积的无
水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。
③沉淀DNA时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀
溶液中加入12体积的5molL NaCl，或加Nh4Ac，使终浓度为
10mmolL；或0.5mL DNA液中加0.125mL4molL NaCl和
0.625mL13%pEG8000(冰浴1h)。④多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。如用TE缓冲液反复清洗共
沉淀物，将清洗液合并再用乙醇沉淀DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂
糖电泳，切下DNA部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还
有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(12体积)，氯苯可以与多糖的羟
基作用而去除多糖。
上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一
定程度上降低DNA的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱
层析方法，使用对DNA具有特异性吸附的树脂来纯化DNA。
4.1.3核外DNA的提取
作为遗传物质的DNA，除细胞核DNA外，在植物中还有线粒体
DNA和叶绿体DNA，在动物中有线粒体DNA，细菌中有质粒DNA。其
中质粒DNA的应用最为广泛，基因的克隆与鉴定、载体骨架的构建等都
离不开质粒DNA。因此，我们首先介绍质粒DNA的抽提。
以大肠杆菌为例，在大肠杆菌中的质粒有大有小，拷贝数有高有
低，因此分离的方法也多种多样。在实践中最常见的操作是通过碱裂解
法提取高拷贝的小质粒。
一般从对数生长期的大肠杆菌细胞中提取质粒。由于绝大多数基因
操作的质粒载体都带有抗生素抗性基因，为了保证在生长过程中质粒不
会丢失，所以在生长培养基中要加入适量的抗生素。最常见的抗生素是
氨苄青霉素，其次是四环素、氯霉素和卡那霉素。
1.碱裂解法提取E.coli质粒DNA的原理
碱裂解法提取质粒DNA是经典的方法，由Birnboim和Doly设计并于
1979年发表。该方法不仅用于大肠杆菌质粒DNA的提取，其工作原理也
广泛应用于其他微生物质粒的提取。
裂解法提取质粒的整个过程主要用到3种溶液，即溶液Ⅰ、Ⅱ和
Ⅲ。其核心原理是，在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持
环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而
将质粒DNA与染色体DNA分开。对于高拷贝的质粒，如pUC和pGEM系
列质粒，一般每毫升培养液可得到3～5μg DNA，可以满足大多数常规
DNA的操作。
在微量抽提过程中，一般取1～2mL菌体培养物，用缓冲液洗去残
液和菌体碎片或分泌物。要提取质粒必须首先破碎细胞让质粒从细胞中
游离出来。为此，第一步先用溶液Ⅰ将细胞悬浮起来。该溶液含有
50mmolL葡萄糖和10mmolL EDTA，其中葡萄糖用于在溶菌酶作用时
维持渗透压；而EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，用于
抑制DNase的活性和抑制微生物的生长。由于E.coli容易破裂，现在不再
加溶菌酶了。但尽管如此，人们仍然习惯使用溶液Ⅰ的初始配方。第二步加入2倍于溶液Ⅰ体积的溶液Ⅱ，该溶液含有0.2molL NaOh和
1%SDS。在这种情况下，细胞会很快破裂，使混浊的细胞悬浮液变成完
全澄清的黏稠液体，此时，在ph12.0～12.5这样狭小的范围内染色体
DNA和蛋白质变性，质粒DNA释放到上清中。细菌蛋白质、破裂的细
胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕形成大型复合物，后者被SDS包
被。虽然碱性溶剂使碱基配对完全破坏，但闭环的质粒DNA双链不会彼
此分离，因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。最后，加入1.5倍于溶液
Ⅰ体积的溶液Ⅲ，该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液(3molL，ph4.6)。
在中和过程中，钾离子取代SDS中的钠离子，复合物从溶液中沉淀下
来。质粒DNA在变性之后经过中和仍保持环状，处于可溶解状态。经高
速离心，上清液即为质粒DNA粗制品。在该粗制品中含有大量的盐，以
及小分子RNA和部分蛋白质，一般不能直接使用。用两倍体积的乙醇进
行DNA沉淀，便可获得质粒DNA样品。此时，该样品可满足一般的操
作要求，如酶切等。在乙醇沉淀之前，可用RNase A去除RNA，用苯酚
氯仿抽提去除蛋白。如果要得到更高纯度的样品，可做进一步纯化处
理，如密度梯度离心等。
2.碱裂解抽提质粒DNA过程中应注意的问题
(1)碱抽提法成功的标志是把染色体DNA、蛋白质和RNA去除干
净，获得一定质量的质粒DNA。去掉染色体最为重要，也较困难，因为
在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入
NaOhSDS溶液与3molL NaAc(ph4.8)溶液，控制好变性与复性操作
时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体
DNA不断裂成小片断，且能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌
液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶菌液加入时可用力振荡几
次，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体DNA尚未释放，不
必担心其分子断裂，但当加入SDS以后，则要注意不能过分振荡，但又
必须让它反应充分，这是一对矛盾，要处理适当。
(2)当加入NaOhSDS溶液5min后，没有看到溶液变黏稠时，不
能进行下一步实验。要检查所用的试剂是否正确，质量是否符合实验要
求(对SDS的质量要求较高，有报道曾用未经重结晶的分析纯的SDS，实验没有成功，后来改用进口的Sigma产品，质粒DNA的收得率很
高)，待找到原因补救后才可继续做下去，不然，提取到最后，将提不
到质粒DNA或收得率极低。
(3)在提取时使用的试剂，除了要用重蒸水配外，所用器皿必须
严格清洗，最后要用重蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都
要进行高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酚对DNA的降解。对Eppendorf
管子、Tip或非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃高温干燥箱中烘干使用。
(4)加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖颠倒摇动4～5次，注
意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放入冰箱中去沉淀
DNA。
(5)乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管内壁的上清液抽干或自然
挥发，不然，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不安全。在用真空泵
抽真空时，气流太强易使DNA飞溅而损失，所以在装有DNA的管口常
用parafilm包装于管口或覆盖一层薄纸，在纸上打若干个小洞。另外，抽真空时间也不要太长，防止DNA成粉末状而遭损失。
(6)最后一次沉淀DNA用的离心管应是干净、灭过菌、最好是经
过硅化的管子(极少量的TE缓冲液不会因吸附在壁上不能完全收集而
损失质粒DNA)。
碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA
可用于酶切、连接与转化。该方法操作不慎，会影响纯度，且步骤复
杂，费时较多。对于相对分子质量较大、拷贝数较少的质粒DNA，由于
DNA片段大易于损伤断裂，因此可选用氯化铯密度梯度离心法抽提
DNA。该方法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超
螺旋构型等特点。
3.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA
现在有些公司开发出了纯化质粒DNA的试剂盒，著名的有Qiagen公
司的产品，如QIAprep Spin Miniprep Kit。其核心技术是使用一种特制的
微型离心纯化柱(QIAprep spin column)，在柱中有一种特殊的硅胶膜
(silica membrane)。在高浓度盐条件下该膜可以结合多至20μg的
DNA，最后用小体积的水或低离子强度的缓冲液可将DNA洗脱出来。
分离纯化过程是通过一个简单的结合—洗涤—洗脱程序来完成的。
首先用碱裂解法获得质粒DNA粗制品，之后将样品通过纯化柱的硅胶
膜，使之吸附质粒DNA。然后用50%乙醇洗涤滤膜，洗去杂质，最后用
少量洗脱缓冲液或水洗脱出纯DNA。纯化的质粒DNA适合大多数酶学
反应，包括限制性酶切和DNA测序等。除了从大肠杆菌纯化质粒外，从
酿酒酵母、枯草牙胞杆菌和根瘤农杆菌中纯化质粒DNA亦可用试剂盒。
这种方法操作简便、回收率高，洗脱出来的DNA可立即使用，无需
沉淀、浓缩或脱盐。因此该产品越来越受到研究工作者的青睐，但同时
也有忘却质粒DNA分离纯化原理的倾向。
除了上述方法外，还有其他方法用于大肠杆菌质粒的提取，对相对
分子质量大且拷贝数很低的质粒有专门的分离方法。
除质粒DNA，核外DNA在植物中还有线粒体DNA和叶绿体DNA，动物中也有线粒体DNA。植物线粒体DNA与核DNA相比，在细胞内含量甚微，提取过程中极易被细胞核及叶绿体DNA污染，因此有一些特殊
的抽提方法；同样，叶绿体DNA以及动物线粒体DNA也有各自特殊的
抽提方法。
国外提取纯化水稻线粒体DNA的方法有：Douce方法、pring方法和
Levings方法，国内有蔗糖不连续梯度方法等。国外提取线粒体的方法
需要的试剂价格昂贵、购买困难等，而国内所用的蔗糖不连续梯度方法
步骤繁琐，特别在吸取中间层黄色液时比较困难，费时又耗材。
高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNaseⅠ法、蔗糖密度梯度
离心法、percoll梯度法、无水法和高盐低ph法等。
动物线粒体DNA的提取方法，主要有：
①氯化铯密度梯度离心法，此法不但设备昂贵，而且实验时间较
长，目前已经很少使用；
②柱层析法，此法所需设备也较昂贵，而且实验时间也较长；
③DNase法，此法在差速离心获得线粒体后，通过DNase消化，有
效地去除线粒体表面附着的核DNA，是目前常用的方法；
④碱裂解法，此法是借鉴质粒快速提取法而建立的，在差速离心获
得线粒体后，通过碱裂解变性，高盐溶液复性，分离环状的线粒体DNA
和线性的核DNA，从而获得线粒体DNA，此法也是目前常用的方法；
⑤改进高盐沉淀法，利用SDS(十二烷基磺酸钠)破坏细胞膜、核
膜，使蛋白质变性，从而游离出核酸。EDTA能抑制细胞中DNA酶的活
性。蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽。加入饱和乙酸钠后，绝大部
分线性大相对分子质量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀，而环
状线粒体DNA仍为自然状态，通过高速离心，除去绝大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质，线粒体DNA仍留在上清中，此法在碱裂解法的
基础上做了一些改进，它们的原理是一样的，都是效仿质粒的提取方
法。
4.1.4RNA的提取
cDNA文库的构建、蛋白质体外翻译、Northern斑点分析等需要一
定纯度和一定完整性的RNA。能否获得完整的RNA，取决于能否最低
限度地避免提取和纯化过程中内源及外源RNase对RNA的降解。由于
mRNA分子结构的特点，容易受RNase的攻击而降解，加上RNase极为
稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNase的污染，并设法
抑制其活性。所有的组织中均存在RNase，人的皮肤、手指、试剂、容
器等均可能被污染，因此全部操作过程均需戴手套并经常更换。
RNA酶抑制剂主要有：
①RNA酶的蛋白质抑制剂。目前从人胎盘分离的一种蛋白质可与多
种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，可使RNA酶失活。此蛋白质在体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸
序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子。由于酚抽
提可以去除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。
②氧钒核糖核苷复合物。这种由氧钒(Ⅳ)离子和4种核糖核苷之
中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNA
酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复
合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度
都是10mmolL。所得到的mRNA可直接在蛙卵母细胞中进行翻译，并
能作为某些体外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核
苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟
基喹啉的苯酚多次抽提以去除之。
细胞内总RNA的抽提方法很多，在实难室中常采用的方法有两种，一种是酚异硫氰酸胍抽提法和硅胶膜纯化法。
1.酚异硫氰酸胍抽提法
TRIZOL试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂，由Gibco公司
根据酚异硫氰酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，适用于
绝大多数生物材料。对任何生物材料的RNA的提取，首先研磨组织或细
胞，或使之裂解；加入TRIZOL试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成
分，还可保持RNA的完整；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；
收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。该RNA样品
几乎不含蛋白质和DNA，可直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA
纯化、体外翻译、RNase保护分析(RNase protection assay)和分子克
隆。
2.硅胶膜纯化法
RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与DNA的分离纯化
思路相似，也就是含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA吸
附在硅胶膜上，从而与其他细胞成分分开，然后在低盐浓度下RNA可从
硅胶膜上洗脱出来。其技术将异硫氰酸胍裂解的严格性和硅胶膜纯化的
速度和纯度相结合，简化了总RNA的分离程序。相当于将异硫氰酸胍裂
解法制备的RNA的水相，通过硅胶膜来纯化。用该试剂盒分离纯化的
RNA纯度高，含有极少量的共纯化DNA。
上述两种方法纯化的RNA如果要用于对少量DNA也敏感的某些操
作，如pCR操作，可使用无RNA酶的DNaseⅠ(RNaseFree DNase Ⅰ)
处理去除痕量的DNA。如果需要特别纯净的样品，可以通过CsCl密度梯
度离心来纯化。
分离的总RNA可利用mRNA3′末端含有poly(A)+的特点，当总
RNA流经oligo(dT)纤维柱时，在高浓度盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐
溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得
到较纯的mRNA。
核酸提取注意事项如下：
(1)在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体
破碎度，以释放更多的游离核酸，常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保
没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。
(2)有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可
在蛋白酶缓冲液中用终浓度为5mmolL的EDTA代替NaCl，并且可将反
应温度提高到50～60℃，并将反应时间缩短到15～25min，但酶用量必
须提高10～20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子
对酶有抑制。
(3)许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用
下，被氧化成有色的醌类物质，影响核酸的提取及降低提取质量，在提
取液中加入pVp和巯基乙醇对降低酚类的干扰可能有所帮助。pVp将与
酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离，且pVp与巯基
乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一
定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
(4)许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具
体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳
观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法：CTAB多次
抽提；在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右)，对低浓度
样品再进行沉淀；在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5molL NaCl作为沉
淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到15～12的体积，异丙醇可用到0.6～
1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐的存在将使大量多糖存在溶液
中，从而达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操
作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
(5)在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力
强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此用酚抽提后，除可能损失部分
核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑
制，因此在操作中既可单用氯仿作变性剂，也可用酚氯仿混合液作变
性剂，也可单用酚作变性剂，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用
氯仿抽提。
(6)在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙
醇，所以一般用2倍体积的乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异
丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多
糖、杂蛋白污染更为有效。在提取核酸时如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，-70℃下大于30min;-20℃过夜将有助于增加核酸的沉
淀量。
(7)在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水，因此时离
子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液
中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外，核酸
样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降
解。
核酸提取后可通过pCR、RTpCR直接扩增出目的基因片断，也可首
先构建文库，然后由RACE、DDpCR等差异显示技术、AFLp等标记技
术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文
库中筛选出完整基因。
4.1.5核酸的纯化
1.超离心
许多细胞器和生物大分子在普通离心力场中不易沉淀，必须在高速
或超速(一般以每分钟2万转以上为超速)离心力场中才会沉降。超离
心按原理可分为两类：沉降速度超离心和沉降平衡超离心。这两种超离
心可用于分析实验，测定核酸的相对分子质量、沉降系数(S)或浮密
度(ρ)，也可用于制备实验以纯化核酸制品。
(1)沉降速度超离心根据被分离物质在强大的离心力场中沉降速
度的不同进行分离。核酸的沉降速度与核酸的相对分子质量、形状、离
心力场的强度及介质的黏度有关。离心力场强度越大、介质黏度越小，则沉降速度越快；核酸相对分子质量越小、形状越伸展，则沉降速度越
慢，沉降系数相应也越小。
沉降速度法中常用5%~20%(WV)蔗糖，用梯度仪或手工预先在
离心管中铺设好连续梯度或阶段梯度，再将核酸样品铺于梯度之上，离
心后分部收集，用电泳法或紫外吸收法检测各分部，即可知核酸所在部
分。
(2)沉降平衡超离心根据被分离物质浮密度ρ(溶剂化密度)的不
同进行分离。核酸的浮密度与核酸的碱基组成、高级结构及溶液介质有
关。含GC越多、结构越紧密的DNA浮密度越高，不同介质与核酸结合
情况不同，会使其浮密度发现变化。
2.凝胶电泳
凝胶电泳是目前应用很普遍的分离纯化核酸的方法，操作简便，设
备易置，而且快速灵敏，在琼脂糖凝胶电泳时，荧光染料EB(溴乙
啶)能插入DNA或RNA的碱基对平面之间而形成荧光络合物，在紫外
光的激发下产生橘黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与
DNA分子长度和数量成正比，所以荧光强度可以表示DNA量的多少。用荧光染料溴乙啶(EB)染色，可检测到少至1ng的DNA。如将已知浓
度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若
用薄层分析扫描仪检测，只需要5～10ng DNA，就可以从照片上比较鉴
别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1mg的DNA。
除了分离纯化核酸外，胶电泳还常用于鉴定核酸制品的纯度和测定
核酸的含量及相对分子质量。胶电泳的材料一般有两种凝胶，一种是聚
丙烯酰胺(polyacrylamide gel,pAG)，孔径小，适合分离1000个核苷酸
以下的核酸分子。另一种是琼脂糖凝胶(agarose)，孔径大，适合分离
较大的核酸分子。
3.柱层析
与其他纯化方法相比，柱层析的优点是容量大，分离量可达毫克级
甚至克级水平。柱层析按原理分有如下几种：凝胶层析、离子交换层
析、亲和层析，此外还有体外重组DNA法、Rloop法和免疫法等。第11章 核酸的检测与保存
4.2.1核酸的检测
由于所用材料的不同，得到的核酸产量及质量均不同。分离纯化的
DNA是否真的存在、是否有降解现象以及DNA经限制性内切酶酶切后
其产物的大小如何等在基因操作中所面临的问题，均需检测所获得核酸
的产量和质量。
目前采用的方法很多，如直接用紫外光谱分析法、EB荧光分析法
和琼脂糖电泳检测。其中最成熟的检测DNA的技术是琼脂糖电泳检测。
1.紫外光谱分析法
由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共轭双键，使核酸分子在紫
外260nm波长处有最大吸收峰，这个性质可用于核酸的定性和定量测
定，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。这要与蛋白
质在280mm波长处有最大的吸收峰相区别，又因为分子生物学实验核酸
提取过程中，蛋白质是最常见的杂质，故常用OD260OD280来检测提取
的核酸纯度如何。
核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少
30%~40%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成
的。
天然双链DNA在260nm处的吸收值与在280nm处的吸收值的比值
(A260A280)为1.8左右。RNA在260nm和280nm处的吸收值之比约为
2.0。根据核酸溶液在260nm波长处的紫外吸收值，可按下式大致估算核
酸的浓度：1A260=50μgmL(双链DNA)，1A260=40μgmL(单链
DNA、RNA)，1A260=20μgmL(寡核苷酸)。
衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值。当
OD260OD280值>1.8时，说明含RNA等杂质；当OD260OD280值1.8
时，说明含蛋白质和苯酚等。当OD260OD2800.9时，该样品可适当稀
释，用TE饱和的酚、氯仿异戊醇各抽提一次，再用无水乙醇沉淀、抽
干，TE悬浮，再用紫外分光光度计测定。由于测定OD260时，难以排除
RNA、染色体DNA以及DNA解链的增色效应的影响，因此测得的数据
往往比实际浓度偏高。用紫外分光光度法可以通过OD260和OD280测出
DNA的浓度和纯度，但不能区分DNA的超螺旋、开环、线状三种构
型，也不能区分染色体DNA。
2.琼脂糖电泳检测
琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物，在高温水溶液下会溶
解，在常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质。在 ......
第1章 基因工程的定义
第2章 基因工程研究的主要内容
第二卷
第3章 限制性核酸内切酶
第4章 DNA连接酶
第5章 末端脱氧核苷酸转移酶
第三卷
第6章 质粒载体
第7章 λ噬菌体载体
第8章 单链DNA噬菌体载体
第9章 人工染色体
第四卷
第10章 核酸的提取与纯化
第11章 核酸的检测与保存
第12章 核酸的凝胶电泳
第13章 分子杂交技术第14章 核酸的序列分析技术
第15章 核酸和蛋白互作研究技术
第16章 通路克隆—Gateway技术
第五卷
第17章 PCR技术的原理
第18章 聚合酶链反应技术类型
第19章 荧光定量PCR技术
第六卷
第20章 基因组DNA文库的构建
第21章 cDNA文库的构建
第七卷
第22章 目的基因与质粒载体的连接
第23章 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
第24章 物理检测法
第25章 免疫化学检测法
第八卷
第26章 外源基因正确表达的基本条件第27章 常用的大肠杆菌表达载体
第28章 外源蛋白质表达部位
第29章 提高外源基因表达效率的方法
第九卷
第30章 酵母菌的基因工程
第31章 丝状真菌的基因工程
第十卷
第32章 目的基因的分离和鉴定
第33章 植物表达载体——启动子
第34章 目的基因的转化方法
第35章 转基因植物中外源基因的沉默
第36章 转基因植物的安全性和对策
第十一卷
第37章 生产转基因动物的关键技术
第38章 转基因动物的检测
第39章 转基因动物技术存在的问题
第40章 转基因动物乳腺生物反应器第十二卷
第41章 基因工程实验室安全性的基本要求
第42章 现代生物技术专利第1章 基因工程的定义
人们对基因的认识经历了长时间的发展过程，而且随着生命科学的
发展，基因的概念还在不断深化。
19世纪中叶，Gregor Mendel通过阐明分离和独立分配规律来解释生
物性状的遗传现象，提出了遗传因子(hereditary factor)的概念，他将
控制豌豆性状的遗传因素称为遗传因子，形成了基因的雏型。1909年，丹麦遗传学家W.Johanssen根据希腊语“给予生命”之义，创造了“gene”一
词。之后，随着T.h.Morgan、O.T.Avery、J.Watson和F.Crike等人的工
作，人们对基因的概念逐渐形成。基因(gene)是一段可以编码具有某
种生物学功能物质的核苷酸序列。基因的研究为基因工程的创立奠定了
坚实的理论基础，基因工程的诞生是基因研究发展的必然结果；而基因
工程技术的发展和应用，又深刻并有力地影响着基因的研究，使我们对
基因的研究提到了空前的高度。随着研究的进一步深入，科学家提出了
移动基因(又称为转位因子，transposable elements)、断裂基因(split
gene)、假基因(pseudogene)、重叠基因(overlapping genes)或嵌套
基因(nested genes)等基因的现代概念。
基因具有以下特点：
①不同基因具有相同的物质基础。原则上，所有生物的DNA都是可
以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，它们的
基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物
的DNA结构都是一样的。有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒
RNA可以通过反转录产生cDNA，并不影响不同基因的重组互换。
②基因是可以切割的。基因在染色体上的存在形式是直线排列。大
多数基因彼此之间存在着间隔，少数基因是重叠排列的。
③基因是可以转移的。生物体内有的基因是可以在染色体上移动
的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。基因在转
移的过程中就完成了基因间的重组。
④多肽与基因之间存在对应关系。现在普遍认为，一种多肽就有一
种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的
性质来检查。
⑤遗传密码是通用的。一系列的三联密码子(除极少数外)同氨基
酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。
⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。经重组的基因一般
来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。
基因工程(genetic engineering)也叫基因操作、遗传工程或重组
DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质(DNA片段)，在体外切割、拼接形成
重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入
到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的
产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。广义的基因
工程，是指DNA重组技术的产业化设计与应用，分为上游和下游技术。
上游技术包括外源基因重组、克隆和表达的设计与构建，即狭义的基因
工程。下游技术包括含有外源基因的生物细胞(基因工程菌或细胞)的
大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。按目的基因的克隆
和表达系统的不同，基因工程分为原核生物基因工程、酵母基因工程、植物基因工程和动物基因工程。
基因工程有两个重要的特征，一是可以通过一定的技术手段把来自
供体的基因转移到受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生
物的遗传特性，创造出生物的新性状；二是某一段DNA可在受体细胞内
进行复制，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学
的研究领域。
1.2基因工程的诞生和发展
1.2.1基因工程的诞生
由于分子生物学和分子遗传学发展的影响，基因分子生物学的研究
也取得了前所未有的进步，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。
这些成就主要包括3个方面：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的
携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物
质基础问题；第二，是在20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模
型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递的问题；第三，是
在20世纪50年代末和60年代初，相继提出了中心法则和操纵子学说，并
成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。随着
DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们的眼前，特别是
当人们了解到遗传密码是由信使RNA转录表达以后，生物学家不再仅仅
满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子水
平上去干预生物的遗传特性。如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码
片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，不就
可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型吗？
这与过去培育生物新品种的传统做法完全不同，它很像技术科学的工程
设计，即按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那
个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种
完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就
被称为“基因工程”，或者称为“遗传工程”。
由于基因工程是一门内容广泛、综合性的生物技术学科，在20世纪60年代科学发展的水平下真正实施基因工程，还存在许多问题，特别是
在技术方面。生物有机体，尤其是具有复杂结构的真核生物，其DNA含
量是十分庞大的。首先要解决的是DNA核苷酸序列的整体结构问题，能
否有效地分离单基因，以实现在体外对它的结构与功能进行深入的研
究，是进行基因操作的重要环节。在20世纪70年代两项关键技术(DNA
分子的切割与连接技术、DNA的核苷酸序列分析技术)从根本上解决了
DNA的结构分析问题。基因操作的第二大技术是载体的使用。在20世纪
70年代，将外源DNA分子导入大肠杆菌的转化获得成功，1972年美国斯
坦福大学的S.Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能
够摄取质粒的DNA。从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的转化受
体。不到四年，世界上第一家基因工程公司“Genetech”注册登记，意味
着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。随着1970年逆转录酶的
发现，无论在理论上还是技术上都已经具备了开展DNA重组工作的条
件。1972年，美国斯坦福大学的p.Berg博士领导的研究小组，率先完成
了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，并提出了体外重组的DNA
分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效表达等问题。在
20世纪60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术，这
对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应用于基因操作实验。
1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时与
S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重
组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已
正式问世，并说明了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因
导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到原核生物细胞中并
在其中实现功能表达。
1.2.2基因工程的发展
自基因工程问世以后的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。如
果说20世纪八九十年代是基因工程基础研究趋向成熟，那么21世纪初将
是基因工程应用研究的鼎盛时期。第2章 基因工程研究的主要内容
1.3.1基因工程的基本过程
对于整个基因操作过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及
产物，而且还影响到产物的量。在基因操作过程中，目的基因是很难获
得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。
如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过pCR或
cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性。基因工程主要
包括以下过程：
(1)材料准备：包括目的基因的制备、受体细胞(宿主)的准
备；
(2)制备重组载体DNA：包括选择合适的载体，用限制性内切酶
分别将外源DNA和载体分子切开，将目的基因与载体于体外重组，形成
重组载体DNA分子；
(3)重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系；
(4)筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中
稳定遗传、正确表达；
(5)表达的外源蛋白的分离纯化。
概括地说，基因工程的过程包括目的基因的获得、载体制备、重组
体制备、基因转移、基因表达、产品分离纯化等。
1.3.2基因工程研究的主要内容
(1)从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或pCR扩增等
步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；
(2)在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复
制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；
(3)将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(宿主细胞)，并与
之一起增殖；
(4)从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子
的受体细胞克隆；
(5)从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目
的基因，供进一步分析研究使用；
(6)将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的
遗传背景下实现功能表达，生产出人类所需要的物质。
基因工程的主体思想是获得外源基因的高效表达，可从四方面达到
目的：
①利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特
性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。
②筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上
游调控序列、操作子、终止子。
③修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。
④工程菌(微型生物反应器)的稳定生产及增殖。
1.4基因工程的研究意义
虽然基因工程的出现给人类带来了一些生物安全性问题，尤其是经
基因工程改造的转基因食品，使人们产生了疑虑和担心，但是实践表
明，基因工程将产生难以估计的经济效益和社会效益，特别是在解决人
类所面临的粮食、能源、疾病、环境等问题。基因工程技术已经在医
学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用，必将为人类作出巨大贡
献。
1.4.1基因工程技术在医学领域中的应用
1.基因工程制药或疫苗
生产基因工程药物的基本方法是，将目的基因用DNA重组的方法连
接在载体上，然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组
织靶细胞)，使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白
质提纯及制成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。
目前，已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新
药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人胰岛素、尿激酶、红细胞生成
素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。具有
高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制
药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏
儒症等提供了有效的药物。2001年全球生物技术公司总数已达4284家，其中上市公司有622家，销售总额约为348亿美元，其中基因药物的销售
额为250亿美元，占总销售额的70%。美国至今已批准了120多种基因工
程药物上市，还有近400种处于临床研究阶段，约3000种处于临床前研
究阶段，基因工程药物的产值和销售额已超过200亿美元。每年平均有
3~4个新药或疫苗问世，在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化
学药物难以达到的作用。
治疗糖尿病的胰岛素，是一种由51个氨基酸残基组成的蛋白质，1982年美国EliLilly公司推出利用基因工程技术制造的人胰岛素，商品名
为humulin。传统的生产方法是从牛的胰脏中提取，每1000磅牛胰脏才
能得到10克胰岛素。通过基因工程方法，把编码胰岛素的基因转入大肠
杆菌细胞中去，造出能生产胰岛素的工程菌，从200升发酵液就可得到
10克胰岛素。
干扰素(interferon,IFN)是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。它是人和动物细胞受
到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后，由受
体细胞分泌的一种具有高度生物学活性的糖蛋白。干扰素被发现时，人
们以为其抗病毒活性为其唯一特性，随着研究的不断深入，人们逐渐发
现IFN除了具有抗病毒活性外，还具有免疫调节、抗肿瘤等生物学功
能。但是，通常情况下人体内干扰素基因处于“睡眠”状态，因而血液中
一般测不到干扰素。即使经过诱导，从人血中提取1mg干扰素，还是需
要人血8000mL，其成本高得惊人。据计算，要获取1磅(453g)纯干扰
素，其成本高达200亿美元，使大多数病人没有使用干扰素的能力。
1980年后，干扰素与乙肝疫苗一样，采用基因工程技术进行生产，其基
本原理及操作流程与乙肝疫苗十分类似。现在要获取1磅(453g)纯干
扰素，其成本不到1亿美元。从人血中分离纯化干扰素治疗一个肝炎病
人的费用高达二三万美元，用基因工程技术生产干扰素治疗一个肝炎病
人大约只需二三百美元。基因工程生产出来的大量干扰素，是基因工程
药物对人类的又一重大贡献。
常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种
疫苗各有自身的弱点，活疫苗隐含着感染的危险性，死疫苗免疫活性不
高，需加大注射量或多次接种。利用基因工程制备重组亚基疫苗，可以
克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含
病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白
质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中而大量生产。
这样得到的亚基疫苗往往效价很高，但绝无感染毒性等危险。
防治乙肝的方法是把一定量的hBsAg(乙肝病毒hBV的外壳蛋白)
注射入人体，就使机体产生对hBV抗衡的抗体。传统乙肝疫苗的来源，主要是从hBV携带者的血液中分离出来的hBsAg，但这种血液中可能混
有其他病原体，而且血液来源也是极有限的，使乙肝疫苗的供应远不能
满足需要。基因工程疫苗解决了这一难题。在酵母中表达乙型肝炎表面
抗原hBsAg产量可达每升2.5mg，已于1984年问世。建立在重组hBs病毒
样颗粒的基因工程乙肝疫苗纯度高，免疫效果好，美国于1986年首先批
准了基因工程乙肝疫苗的生产。来源于酵母菌的hBs疫苗不仅是首次，也是至今唯一批准的重组疫苗。截至2000年3月已有116个国家将乙肝疫
苗纳入常规免疫接种项目中。然而疫苗逃避突变的出现提出了如何改进
的问题，综合策略是增加靶(B细胞、T细胞和CTL表位)的数量，例如
来源于prS、核心蛋白质等其他hBV的抗原，这样一个或一些突变不至
于使病毒逃避免疫监测。目前已研制的包含pres的肝核心疫苗能够加强
和加快细胞和体液免疫应答，解决抗hBs的非应答。其他包含pres的hBs
疫苗的候选疫苗具有快的血清保护和预防决定簇α逃避突变的作用。已有研究显示外源性和细胞内产生的hBc有导致细胞应答的潜能，能够控
制hBV病毒，并最后消灭hBV感染。因此，hBc颗粒独异的免疫特性以
及CTL表位等都可能为新的治疗性hBV疫苗的发展提供机会。
2.基因工程用于基因治疗
人体基因的缺失，将导致一些遗传疾病。若将缺失的目的基因用
DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入人体组织靶细胞，使目
的基因表达，达到治疗的目的，即基因治疗，这已成为基因工程在医学
方面应用的又一重要内容。1979—1980年，美国加州大学洛杉矶分校的
研究员Martin Cline博士进行了人类历史上第一次替代基因治疗，将重组
DNA转入来自意大利和以色列的2例遗传性血液病患者的骨髓细胞中，由于此次治疗事前并未征得加州大学主管部门及RAC的批准，也未向患
者所在国家政府部门详细通报有关情况，因此遭到了社会舆论的谴责。
1990年9月14日，Blease等做了人类历史上经批准的第一次基因治疗，受
试对象为1例4岁严重复合性免疫缺陷(severe combined
immunodeficiency，SCID)患儿，SCID为腺苷脱氨酶(adenosine
deaminase，ADA)缺乏所致，患儿生活在免疫隔离状态下。治疗时，先提取患儿适量白细胞，经实验室处理，插入正常人ADA基因后，再输
入患儿体内，治疗后患儿免疫力增强，不再反复发生感冒，并可上学。
目前，基因治疗的前期与临床研究绝大部分是针对肿瘤的。治疗方
案的设计包括目的基因的选择、载体的选择及治疗方式的选择等。方案
设计的原则是最大限度地满足有效性、安全性和特异性三方面的要求，其中特异性与有效性和安全性均有关系。在基因治疗的病毒载体选择方
面，应用最早的为逆转录病毒载体。由于病毒滴度低，以及可能存在的
插入突变、同源重组等，使其应用受到限制。但由于逆转录病毒可持久
表达，无需反复应用，且只感染“生长”性细胞，特别是生长旺盛的癌细
胞，使治疗具有一定的针对性，这在很大程度上避免了外源基因对正常
组织的损伤，所以，逆转录病毒仍具有一定的优势。目前研究较多的病
毒载体为腺病毒及腺病毒相关病毒。腺病毒虽然感染性强，滴度高，但
不能在细胞内持久表达，因为腺病毒基因不能插入宿主染色体内，且能
引起宿主强烈的免疫反应，致使宿主器官严重损害而危及生命。1999年
9月13日，美国宾州大学人类基因治疗研究所利用腺病毒作载体对一名
18岁患者进行鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因治疗，4天后患者死亡，死亡
原因为腺病毒引起的免疫反应导致重症肝炎、多器官功能衰竭。因此，腺病毒作为载体的安全性令人担忧。
现有的胰岛素治疗方法包括胰岛素泵、胰岛细胞及胰腺的移植等，均存在许多弊端，如低血糖、供体不足、免疫排斥等。基因工程细胞能
模拟正常胰岛β细胞的功能，表达、储存、分泌胰岛素并实现葡萄糖介导的胰岛素分泌，可用于糖尿病胰岛素替代治疗。用于糖尿病基因治疗
的细胞系包括神经内分泌细胞和非神经内分泌细胞。将葡萄糖转运子
2、葡萄糖激酶、细胞外信号调节激酶12、CD38、胰十二指肠同源盒1
等基因导入神经内分泌细胞系ArT20、RIN、BTC、MIN、GTC1，可使
它们具有葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力；将点突变的胰岛素基因、furin
及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、含葡萄糖反应元件、葡萄糖6磷酸
酶基因的启动子等转入各种非神经内分泌细胞系中，也实现了胰岛素基
因的调控表达和分泌，并产生成熟的胰岛素。无论是神经内分泌细胞，还是非神经内分泌细胞经基因修饰、改建后均可大量分泌具有生物活性
的胰岛素，但胰岛素表达的调控，特别是葡萄糖调控下的胰岛素基因的
表达及胰岛素分泌还未较好地解决，这也是今后研究的方向。如何将具
有治疗作用的基因工程细胞导入糖尿病动物体内甚至糖尿病患者体内，使其在体内能正常发挥作用仍是糖尿病基因治疗中需要解决的问题。
1.4.2基因工程在农业领域中的应用
1983年首例转基因作物(烟草、马铃薯)问世，1986年首批转基因
作物批准进行田间试验，1992年中国成为世界上第一个商品化种植转基
因作物的国家，开创了转基因作物商品化应用的先河。当时种植的是一
种抗黄瓜花叶病毒(CMV)和抗烟草花叶病毒(TMV)的双价转基因
烟草，种植面积达到8600公顷。1994年美国孟山都公司下属Calgene公
司研制的延熟保鲜转基因番茄在美国批准上市，这是发达国家批准商业
化的第一个转基因作物。随后，转基因作物的商业化种植面积和经济效
益迅速扩大。在过去的十几年里，全球转基因植物的种植面积由1996年
的170万公顷增长到了2007年的1.143亿公顷。我国实施“863”计划多年
来，生物技术水平不断提高，生物技术产业也初具规模，应用生物技术
育种的许多转基因作物得到大面积的推广。
运用基因工程技术，把特定的基因转入农作物中，构建转基因植
物，具有抗虫害，抗病毒、细菌和真菌病害，抗除草剂，良好的开花习
性(如开花时间和花色)，良好的果实和球茎成熟储藏特性(如延迟成
熟、延长花架期的番茄、减少马铃薯储藏是使用发芽抑制剂用量)，抗
逆(如冷、热、渍、旱和盐碱土壤)，保鲜，高产，高质的优点。例
如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)所产生的毒素蛋白(BT)
对许多鳞翅类害虫有杀灭作用，已有喷洒苏云金芽孢杆菌发酵产物或提
纯了的BT于农作物叶面，用于虫害防治的实验。1996年浙江农业大学
核农所教授高明尉等带领课题组运用转基因技术将苏云金杆菌的杀虫蛋
白基因(Bt基因)导入水稻，并于1998年获得了抗螟虫的种质资源克螟
稻1号和2号。克螟稻稳定地传递和表达了抗螟基因，对常见的二化螟、三化螟和纵卷叶具有高度的抗性，危害水稻的螟虫的幼虫一旦吃了这种水稻的茎叶，两天之内就会死亡。另外，转基因动物实验首先在小鼠获
得成功，之后随着“多莉”羊、恒河猴等动物转基因实验的不断成功，现
在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从牛羊奶中可以生产蛋白质药
物，称为“乳腺反应器”工程。把生长激素基因转入奶牛或肉牛，提高牛
奶产量，提高饲料转化率等等，亦有实验报道。但是，转基因植物动
物真正达到实际应用，还需许多基础研究，还有很长的路要走。
1.4.3基因工程在工业领域中的应用
除转基因动物和植物外，工程菌也获得了快速的发展，并在环境工
程、工业生产等领域得到广泛的应用。油轮的海上事故常常使海面和海
岸产生严重的石油污染，造成生态问题。早在1979年美国GEC公司构建
成具有较大分解烃基能力的工程菌，并经美国联邦最高法院裁定，获得
专利。这是第一例基因工程菌专利。无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻基因工
程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交
流，迅速并定向地获得人类需要的新的生物类型。
酿酒、食品、发酵、酶制剂等工业门类均利用微生物代谢过程。基
因工程方法在改造所用微生物的特性中有极大潜力，因此，可以应用在
工业生产的许多方面，提高质量、改进工艺或发展新产品。在啤酒酿造
中，主要的发酵微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，酿酒
酵母可把麦芽汁中的葡萄糖、麦芽糖、麦芽二糖等成分转变成乙醇。但
是麦芽汁中还有约占碳水化合物总数20%的糊精不能被酿酒酵母利用。
另一种酵母叫糖化酵母(S.diastaticus)，能分泌把糊精切开成为葡萄糖
的酶，但由此生产的啤酒口味不好。用基因工程技术，把糖化酵母中编
码切开糊精的酶的DNA基因引入酿酒酵母中，这样的酿酒酵母工程菌能
最大限度地利用麦芽中的糖成分，使啤酒产量大为提高，并且因为残余
糊精量的降低，亦提高了啤酒的质量。在白酒和黄酒的酿造中，常用霉
菌产生的淀粉水解酶使淀粉糖化，然后由酿酒酵母把糖转化为乙醇，淀
粉需先经高温蒸煮，淀粉颗粒溶胀糊化，才能被霉菌产生的淀粉糖化酶
所作用。蒸煮消耗的能量甚多，不少实验室已经试验将淀粉糖化酶基的
基因转入酿酒酵母，使淀粉糖化及乙醇发酵两步操作均由酵母来完成，并且力求免去蒸煮过程，可以大大节约能源。干酪是高附加值奶制品，且有极高的营养价值。制造干酪需要大量的凝乳酶。传统的方法是从哺
乳小牛的第四个胃中提取凝乳酶粗制品，这当然很不经济。现在已经做
到将小牛的凝乳酶基因转入酿酒酵母中去，经酵母菌培养生产出大量具
天然活性的凝乳酶，用于干酪制造业。近来把乳酸克鲁维酵母
(Kluyveromyces lactis)的水解乳糖的基因转入酿酒酵母，使得可利用
乳清发酵来产生酒精。
本章小结本章简要介绍了基因工程的概念、基因工程诞生的基本理论基础和
技术基础、基因工程的发展，以及基因工程的研究内容、基本过程和基
本原理，并用实例说明基因工程在医学、农业、工业等领域中的应用。第3章 限制性核酸内切酶
在基因工程中，大量应用的是作用于核酸的酶。生物体内与核酸有
关的酶很多，例如核酸聚合酶、核酸水解酶等。核酸酶类是基因工程操
作中必不可少的工具酶，基因克隆的许多步骤都需要使用一系列功能各
异的核酸酶来完成。本章主要介绍以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等为主的多种核酸酶的性质和用途。
2.1.1限制性核酸内切酶的发现
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。在20世纪50年代，人们在研究噬菌体的宿主范
围时，发现在不同大肠杆菌菌株(例如K菌株和B菌株)上生长的λ噬菌
体(分别称为λ。K和λ。B)能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞K
菌株和B菌株，但当它们分别与其宿主菌交叉混合培养时，则感染频率
下降。一旦λ。K噬菌体在B菌株中感染成功，由B菌株繁殖出的噬菌体
的后代便能像λ。B一样高频感染B菌株，但却不再感染它原来的宿主K
菌株，原因是大肠杆菌K菌株和B菌株中含有各自不同的限制与修饰系
统，λ。K和λ。B分别长期寄生在大肠杆菌的K菌株和B菌株中，宿主细
胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了
自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。当外来DNA入侵时，便遭
到宿主限制性核酸内切酶的特异性降解。在降解过程中，偶尔会有极少
数的外来DNA分子幸免而得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿
主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主
菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。这种由宿主控制的对外
源DNA的限制(restriction)和对内源DNA的修饰(modification)现象
称为宿主细胞的限制和修饰作用。
几乎所有的细菌都能产生限制性核酸内切酶。由于限制性核酸内切
酶的发现，基因操作才成为可能。为此，在发现限制性核酸内切酶工作
中做出突出贡献的科学家W.Arber、h.Smith和D.Nathans荣获了1978年度
诺贝尔生理学或医学奖。
宿主细胞的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中，它有两方面的
作用，一是保护自身DNA不受限制；二是破坏入侵的外源DNA，使之
降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。
外源DNA可以通过多种方式进入某一生物体内，但是它必须被修饰成受
体细胞的限制性内切酶无法辨认的结构形式，才能在宿主细胞内得以生
存，否则会很快被破坏。因此，在基因工程中，常采用缺少限制作用的
菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。例如，大肠杆菌K12的限
制缺陷型R—km+k，不能降解外源DNA，但具有修饰功能，这类突变株经常用于转化实验。R—km—k属于限制和修饰缺陷型，既无限制功
能，又无修饰功能，也常用于转化实验。
2.1.2限制性核酸内切酶的分类
目前已经鉴定出三种不同类型的限制性核酸内切酶，M.Meselson和
R.Yuan(1968)最早从大肠杆菌的限制与修饰系统中分离到限制性核酸
内切酶，这种酶后来被命名为Ⅰ型限制性核酸内切酶。Ⅰ型限制性核酸
内切酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATp酶和DNA解旋酶四种活性，其
切割作用是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位
置上切割，不产生特异片段。因此，Ⅰ型限制性核酸内切酶在基因操作
中没有实用价值。
1970年，h.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血杆菌
(haemophilus influenzae)分离出第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶
hindⅡ。Ⅱ型限制性核酸内切酶仅需要Mg2+，可识别双链DNA分子上
的特定序列，并且其切割位点与识别位点重叠或靠近，产生具有一定长
度的DNA片段，因此在基因克隆中广泛使用。
Ⅲ型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限
制与修饰双重作用，其中M亚基负责位点的识别与修饰，R亚基具有核
酸酶活性，酶的切割作用需要ATp、Mg2+和S腺苷甲硫氨酸等辅助因
子。切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与
识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同，在基因克隆中很少
使用Ⅲ型限制性核酸内切酶。
2.1.3限制性核酸内切酶的命名以及识别特点
由于发现的限制性核酸内切酶越来越多，所以需要有一个统一的命
名规则。h.O.Smith和D.Nathans于1973年提议的命名系统已被广大学者
所接受。他们提议的命名原则包括以下几点：
(1)用具有某种限制性内切酶有机体属名的第一个字母(大写)
和种名的前两个字母(小写)组成酶的基本名称。例如大肠杆菌
(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(haemophilus influenzae)
用hin表示。
(2)用一个写在右方的字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制
与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的宿主菌的种名
右方附加一个标注字母，表示这是染色体外的成分。
(3)如果一种特殊的菌株中，具有几个不同的限制修饰体系，则
以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如，流感嗜血菌
Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为hindⅠ，hind Ⅱ，hind Ⅲ等，hind Ⅲ是在haemophilus influenzae(流感嗜血杆菌)的d菌株中发现的第
三个酶；EcoR I表示在Escherichia coli(大肠杆菌)中的抗药性R质粒上发现的第一个酶。
(4)有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系统名称。限制
性核酸内切酶的系统名称为R，甲基化酶为M。例如R.hind Ⅲ表示限制
性核酸内切酶，相应的甲基化酶用M.hind Ⅲ表示。但在实际应用中，限
制性内切酶的系统名称R常被省略。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别特点有以下方面：
(1)大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列长度为4～6个碱基
对，一般富含GC。有少数限制性内切酶可识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有酶，如Not I(GCGGCCGC)。
(2)识别序列具有双重旋转对称的回文结构(palindromic
sequence)。对称轴位于第三和第四位碱基之间；对于由5对碱基组成的
识别序列而言，其对称轴为中间的一对碱基。
2.1.4Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式
大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部水解磷酸二酯键
中3′位的酯键，产生3′端为羟基、5′端为磷酸基团的片段。切割后形成3
种不同末端结构的DNA片段：
①在识别序列的对称轴上同时切割，形成平端(blunt end)，如
Sma Ⅰ；
②在识别序列对称轴的5′端切割，产生5′端突出的末端，如EcoR
Ⅰ：
③在识别序列对称轴的3′端切割，产生3′端突出的末端，如pst Ⅰ。
任何一种Ⅱ型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互
补，因此这种末端称为黏性末端(cohesive end)。限制性核酸内切酶识
别的靶序列与DNA来源无关，根据这一特性，我们可以将任意两个不同
来源的DNA片段连接，构成一种新的重组DNA分子。
有些不同微生物来源的酶，能识别相同的序列，切割位点相同或不
同，其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶
(isoschizomer)。例如hpaⅡ与MspⅠ的识别序列和切割位点都相同
(C↓CGG)，它们是一对同裂酶，Sma Ⅰ(CCC↓GGG)和Xma
Ⅰ(C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不同，前者产生平头末
端，后者产生黏性末端。
2.1.5Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件
在合适的温度和缓冲液中，在20μL反应体系中，1h完全降解1μg
DNA所需要的酶量，称为一个单位的限制性核酸内切酶。加入的酶过
量，其贮存液中的甘油会影响反应，而且许多限制性核酸内切酶过量可
导致识别序列的特异性下降。当DNA酶切后不需进行进一步的酶反应
时，可加入酚氯仿抽提，然后乙醇沉淀，使酶终止反应。限制性核酸内切酶切割DNA是基因重组技术中的重要环节，直接关
系到整个实验的成败，因此在操作过程中，应注意下列问题：①浓缩的
酶液可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释(不能用水稀释，以免酶变
性)，稀释的酶液不能保存过长时间，要尽快用完。②限制性核酸内切
酶在含50%甘油的缓冲液中，于—20℃稳定保存。一般总是在其他试剂
加完后，再加入限制性核酸内切酶。每次取酶必须使用新的无菌吸头。
应尽快操作避免反复冻融。
2.1.6影响限制性核酸内切酶活性的因素
1.DNA的纯度
限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率在很大程度上取决于所
使用的DNA本身的纯度。DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯
仿、酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠(SDS)以及高浓度的盐离
子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。应用微量碱抽提法制备
的DNA制剂，常常含有这类杂质。为了提高限制性核酸内切酶对低纯度
DNA制剂的反应效率，一般采用增加限制性核酸内切酶的用量，扩大酶
催化反应的体积和延长酶催化反应的保温时间等措施。
2.DNA的甲基化程度
限制性核酸内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识
别序列中特定核苷酸的甲基化作用便会强烈地影响酶的活性。通常从大
肠杆菌宿主细胞中分离出来的质粒DNA，都混有两种作用于特定核苷酸
序列的甲基化酶，一种是dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残
基甲基化；另一种是dcm甲基化酶。因此，从正常的大肠杆菌菌株中分
离出来的质粒DNA，只能被限制性核酸内切酶局部消化，甚至完全不被
消化，是属于对甲基化作用敏感的一类。
为了避免产生这样的问题，在基因工程操作中通常使用丧失了甲基
化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。哺乳动物的DNA有时也会带有5甲
基胞嘧啶残基，而且通常是在鸟嘌呤核苷残基的5′侧。因此，不同位点
之间的甲基化程度是互不相同的，且与DNA来源的细胞类型有密切的关
系。可以根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性对真核基因组
DNA的甲基化作用模式进行研究。例如，当CCGG序列中内部胞嘧啶残
基被甲基化之后，MspⅠ仍会将它切割，而hpaⅡ(正常情况下能切割
CCCG序列)对此类的甲基化作用则十分敏感。
限制性核酸内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，这种特性在有
些情况下具有特殊的用途。例如，当甲基化酶的识别序列同某些限制酶
的识别序列相邻时，就会抑制限制酶在这些位点发生切割作用，这样便
改变了限制酶识别序列的特异性。另一方面，若要使用合成的衔接物修
饰DNA片段的末端，一个重要的处理是必须在被酶切之前，通过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。
3.酶切反应的温度
DNA消化反应的温度是影响限制性核酸内切酶活性的另一重要因
素。不同的限制性核酸内切酶具有不同的最适反应温度，而且彼此之间
有相当大的变动范围。大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是
37℃，但也有许多例外的情况，有些限制性核酸内切酶的标准反应温度
低于标准的37℃，例如SmaⅠ是25℃，ApaⅠ是30℃。消化反应的温度
低于或高于最适温度都会影响限制性核酸内切酶的活性，甚至导致酶的
完全失活。
4.DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有很大的影响。
某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线
性的DNA高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些限制性核酸内
切酶切割位于DNA不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。
5.限制性核酸内切酶的缓冲液
限制性核酸内切酶的标准缓冲液的组分包括氯化镁、氯化钠或氯化
钾、Tris·hCl、β巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白
(BSA)等。酶活性的正常发挥，需要2价阳离子，通常是Mg2+。不正
确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识
别序列特异性的改变。缓冲液Tris·hCl的作用在于，使反应混合物的ph
值恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大多数限制酶来说，在
ph=7.4的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保护某些限制性核酸内切
酶的稳定性是有用的，而且还可使其免于失活。在“非最适的”反应条件
下(包括高浓度的限制性核酸内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用
Mn2+取代Mg2+以及高ph值等等)，有些限制性核酸内切酶识别序列的
特异性会发生改变，导致从识别序列以外的其他位点切割DNA分子。有
的限制性核酸内切酶在缓冲液成分的影响下会产生所谓的“星号”活性。第4章 DNA连接酶
2.2.1连接机理
1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在两条
DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(DNA ligase)。
DNA连接酶广泛存在于各种生物体内。在大肠杆菌及其他细菌中，DNA连接酶催化的连接反应是利用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作
为能源；在动物细胞及噬菌体中，DNA连接酶则是利用ATp(腺苷三磷
酸)作为能源。其催化的基本反应是将一条DNA链上的3′末端游离羟基
与另一条DNA链上的5′末端磷酸基团共价结合形成3′，5′磷酸二酯键，使两个断裂的DNA片段连接起来，因此它在DNA复制、修复以及体内
体外重组过程中起着重要作用。
DNA连接酶催化的连接反应分为三步：
①由ATp(或NAD+)提供AMp，形成酶AMp复合物，同时释放出
焦磷酸基团(ppi)或烟酰胺单核苷酸(NMN)；
②激活的AMp结合在DNA链5′端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键
的焦磷酸酯键；
③与相邻DNA链3′端羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMp。
值得注意的是，DNA连接酶所连接的是切口(nick)，无法连接裂
口。另外，DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA
分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
2.2.2DNA连接酶的种类
已发现的DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶(又称
T4DNA连接酶)和大肠杆菌DNA连接酶。
T4噬菌体DNA连接酶(又称T4DNA连接酶)的相对分子质量为
68000，最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。T4噬菌体DNA连
接酶可以连接：
①两个带有互补黏性末端的双链DNA分子；
②两个带有平头末端的双链DNA分子；
③一条链带有切口的双链DNA分子；
④RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA
链连接。由于T4噬菌体DNA连接酶可连接的底物范围广，尤其是能有
效地连接DNA分子的平头末端，因此在DNA体外重组技术中广泛应
用。
虽然两个完全断开的平头末端DNA分子在T4噬菌体DNA连接酶作
用下可以连接，但是连接速度非常缓慢，因此需要回收大量的酶切片
段。在平头末端连接反应中，若加入适量的一价阳离子和低浓度的pEG，可提高T4噬菌体DNA连接酶对平头末端的连接活性。
大肠杆菌DNA连接酶的相对分子质量为75000，需要NAD+作辅助
因子。大肠杆菌DNA连接酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连
接，它的适合底物是一条链带切口的双链DNA分子和具有同源互补黏性
末端的不同DNA片段。
2.2.3DNA连接酶的反应体系
由于T4噬菌体DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平头末
端，所以比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛。T4噬菌体DNA连接酶的活
性单位有多种定义，较通用的是韦氏(Weiss)单位。一个韦氏单位是
指在37℃，20min内催化1nmol32p从焦磷酸根置换到γ，β32pATp所需要
的酶量。
连接反应根据DNA片段的分子大小及末端结构，在12～30℃下反应
1～16h。对于黏性末端一般在12～16℃之间进行反应，以保证黏性末端
退火及酶活性、反应速率之间的平衡。平头末端连接反应可在室温进
行，并且需用比黏性末端连接大10～100倍的酶量。终止反应可加人
2μL0.5molL的EDTA或者75℃水浴10min。
2.2.4影响连接反应的因素
DNA片段的连接过程与许多因素有关，如DNA末端的结构、DNA
片段的浓度和相对分子质量、不同DNA末端的相对浓度、反应温度、离
子浓度等。
重组子的分子构型与DNA片段浓度及DNA分子长度存在密切关
系。对于长度一定的DNA分子，其浓度降低有利于分子环化。DNA浓
度增加，有利于分子间的连接，形成线性二聚体或多聚体分子。对于两
个以上的DNA分子的连接，如载体DNA与外源插入片段，要考虑载体
与插入片段的末端浓度的比例。
对于黏性末端，一般在12～16℃之间进行反应。平头末端连接反应
的最适温度一般为10～20℃，温度过高(>30℃)会导致T4噬菌体DNA
连接酶的不稳定。
DNA聚合酶
DNA聚合酶(DNA polymerase)催化以DNA为模板合成DNA的反
应。它能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链
DNA分子引物链的3′Oh末端，催化核苷酸的聚合作用。根据DNA聚合
酶所使用的模板不同，将其分为两类：
①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(全
酶)、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等；
②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
目前，已从大肠杆菌中分离到三种不同类型的DNA聚合酶，即
DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。在大肠杆菌中，DNA
聚合酶Ⅰ和DNA聚合酶Ⅱ的主要功能是参与DNA的修复，而DNA聚合
酶Ⅲ与DNA复制有关。在分子克隆中常用的是DNA聚合酶Ⅰ。
DNA聚合酶Ⅰ也称为Kronberg酶，是Kronberg等于1956年发现的第
一个DNA聚合酶。它具有3种活性，即5′→3′DNA聚合酶活性、5′→3′外
切酶活性和3′→5′外切酶活性。3′→5′外切酶活性的主要功能是识别并切
除错配碱基，通过这种校正作用保证DNA复制的准确性。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的主要用途是通过DNA切口平移来制备杂
交探针。在Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶Ⅰ(DNase Ⅰ)处理双链
DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性
和聚合酶活性可以同时发生。外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个
核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。由于大肠杆
菌DNA聚合酶Ⅰ不能使断裂处的5′p和3′Oh形成磷酸二酯键而连接，所
以随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象称为切口
平移(nick translation)。如果在反应体系中加入放射性核素标记的核苷
酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA
分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针。
2.3.2Klenow片段
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌蛋白酶处理后可切割产生两个大
小片段，其中较大的片段具有聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，称为
Klenow片段或Klenow聚合酶。较小的片段具有5′→3′外切酶活性，定位
于酶分子的N末端；Klenow片段具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活
性。
在分子克隆中，Klenow酶的主要用途是：
①补平DNA的3′凹陷末端，包括带裂口的双链DNA的修复；
②对带3′凹陷末端的DNA分子进行末端标记；
③在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；
④用于Sanger双脱氧末端终止法进行DNA的序列分析。
与切口平移法不同，DNA末端标记并不是将DNA片段的全长进行
标记，而是只将其一端(5′或3′)进行部分标记。在使用Klenow酶进行
DNA末端标记时，DNA片段应具有3′凹陷末端。Klenow酶不能直接用
于3′突出末端DNA的标记。
2.3.3T4噬菌体DNA聚合酶
T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，相对分子质量为1140。具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，而且3′→5′外
切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强，T4DNA聚合酶的外切
酶活性比Klenow酶高100～1000倍。
T4噬菌体DNA聚合酶可以补平或标记带3′凹陷末端的DNA分子，还
可进行平头末端或3′突出末端的双链DNA的标记以及特异探针的制备。
另外，T4噬菌体DNA聚合酶还能将双链DNA的末端转化成平头末端。
2.3.4T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶
T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是所有已
知的DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个酶。此外，T7噬菌体DNA
聚合酶还具有很强的对单链和双链DNA的3′→5′外切酶活性，其活性约
为Klenow酶的1000倍。T7噬菌体DNA聚合酶在分子克隆中主要用于催
化大分子模板(如M13噬菌体)的引物延伸反应，它可以在同一引物模
板上有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构的影响；也可类似T4噬菌
体DNA聚合酶应用于DNA分子的3′末端标记。
测序酶是通过化学修饰或基因工程方法对T7噬菌体DNA聚合酶进
行改造的酶，它不具备T7噬菌体DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性，保留
其聚合活性，具有很强的持续合成能力，是Sanger双脱氧末端终止法对
长片段DNA进行测序的理想用酶。
2.3.5Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是第一个被发现的耐热的DNA聚合酶，它最初是从
极度嗜热的栖热水生菌(Thermus aquaticus)中纯化而来的。Taq DNA
聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，需要Mg2+作辅助因
子，最适温度为75～80℃。由于Taq DNA聚合酶具有高度的耐热性，所
以在分子克隆中主要是通过聚合酶链反应(pCR)对DNA分子的特定序
列进行体外扩增。
已从多种耐热菌中分离出耐热性更好的DNA聚合酶，如从Thermus
thermophilus中分离出来的Tth DNA聚合酶，从Thermococcus litoralis中
分离出来的“Vent”DNA聚合酶，从Bacillus stermophilus中分离出来的Bst
DNA聚合酶等。
2.3.6逆转录酶
逆转录酶(reverse transcriptase)又称为RNA指导的DNA聚合酶。
已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，现在常用的两种逆转录酶
分别来自纯化的鸟类骨髓母细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)和Moloney鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)。AMV逆转录酶反应的最适温度为41～45℃，最适ph为8.3。
逆转录酶具有以下催化活性：
①5′→3′聚合酶活性，逆转录酶能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，但是后者的合成很慢；
②RNA酶h活性，能从5′或3′方向特异地降解DNA:RNA杂交分子中
的RNA链。
在体外以mRNA为模板合成其互补DNA是逆转录酶的最主要用途。
它可应用两种引物，一种是寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷，即oligo(dT)，另
一种是随机序列的核苷酸寡聚体。另外，逆转录酶还用于3′凹陷末端的
标记、杂交探针的制备和DNA序列测定。第5章 末端脱氧核苷酸转移酶
末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase)简称
末端转移酶。末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化DNA的聚合作
用，这种聚合作用不需要模板，反应需要Mg2+，其合适底物为带有
3′Oh突出末端的双链DNA。对于平头末端或带3′Oh凹陷末端的双链
DNA和单链DNA，末端转移酶催化的聚合作用仍能进行，但需Co2+激
活，且反应效率低。
在分子克隆中，末端转移酶的主要用途是给载体和外源DNA分别加
上互补的同聚体尾巴，以便两者在体外连接。末端转移酶的另一个用途
是进行DNA的3′Oh末端标记，标记物可以是放射性的，如α32pdNTp，也可以是非放射性的，如生物素11dUTp，它们可用于DNA序列分析、DNase Ⅰ足迹分析、分子杂交等实验中。
2.5S1核酸酶
S1核酸酶来源于米曲酶菌(Aspergillus oryzae)，是一种高度单链
特异的核酸内切酶。它可用于切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末
端、在双链cDNA合成时切除发夹环结构等实验操作中。通常水解单链
DNA的速率要比水解双链DNA快75000倍。这种酶需要低水平的Zn2+激
活，最适ph值范围为4.0~4.3。S1核酸酶作图(S1nuclease mapping)法
在测定杂交核酸分子(DNA∶DNA或DNA∶RNA)的杂交程度、RNA
分子定位、确定真核基因中内含子的位置、内含子与外显子剪切位点的
定位、转录起始位点与终止位点的测定中，都是十分有效的工具。
当克隆的基因组DNA片段与细胞的mRNA混合时，DNA中的外显
子序列与相应的mRNA之间通过碱基互补，形成杂合双链分子，而内含
子序列仍保持单链，并突出成为环状。用S1核酸酶处理，该酶能水解所
有的单链区域，结果得到一个因内含子被降解而带有切口的
DNA∶mRNA分子。再用碱处理破坏RNA链，回收的DNA片段就是该
基因的编码序列，其大小和数目可通过琼脂糖凝胶电泳来判断，所以用
这种方法可以测定内含子的大小。
2.6核酸外切酶
核酸外切酶(exonuclease)是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降
解核苷酸的酶。按照酶对底物二级结构的专一性，将其分为三类：①作
用于单链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ和大肠杆菌核酸外切
酶Ⅶ；
②作用于双链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ、λ噬菌体
核酸外切酶等；
③既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶。大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ可以从单链DNA的两个末端降解DNA分
子，产生短的寡核苷酸片段；对于带黏性末端的双链DNA，大肠杆菌核
酸外切酶Ⅶ可将末端削平，变为平头末端。反应不需要Mg2+。它主要
应用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置。
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ对双链DNA具有高度特异性，可降解平头末
端、3′凹陷末端及有切口的DNA，但不能降解单链DNA和带3′突出末端
的双链DNA，要求Mg2+或Mn2+作辅助因子。核酸外切酶Ⅲ的主要用途
是通过部分降解双链DNA片段，产生部分单链DNA区域，作为DNA聚
合酶的模板。生成的DNA分子可以用作特异探针的制备。
Bal31核酸酶来源于埃斯波加纳互生单胞菌
Bal31(Alteromonasespejiana Bal31)，主要表现为3′外切酶活性，同时
伴有5′外切及较弱的内切活性，需要Mg2+和Ca2+。对于单链DNA，具
有特异的内切酶活性，可从3′Oh末端迅速降解DNA，而5′端切割速率较
慢。对于双链DNA，具有3′→5′外切酶活性和5′→3′外切酶活性，可从3′
和5′两端切除核苷酸，其机理是以3′外切酶活性迅速降解一条链，随后
在互补链上进行缓慢的5′端内切反应。
2.7T4噬菌体多核苷酸激酶
T4噬菌体多核苷酸激酶(T4phage polynucleotide kinase)来源于T4
噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸
激酶。该酶具有多种功能，例如T4噬菌体多核苷酸激酶可催化ATp的γ
磷酸基团转移到单链或双链DNA或RNA的5′Oh末端。另外，它还具有3′
磷酸酶活性。T4噬菌体多核苷酸激酶能催化寡核苷酸的3′磷酸水解成为
3′Oh，底物可以是3′磷酸脱氧核苷、3′，5′二磷酸脱氧核苷和3′磷酸多核
苷酸。
在实际应用中，主要是利用多核苷酸激酶能进行DNA或RNA的5′末
端标记和在连接反应之前，使缺乏5′磷酸的DNA或接头磷酸化。
2.8碱性磷酸酶
常用的碱性磷酸酶有两种，一种来源于大肠杆菌，叫做细菌碱性磷
酸酶(bacterial alkaline phosphatase，BAp)；另一种来源于小牛肠，叫
做小牛肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIp)。小牛
肠碱性磷酸酶(CIp)的相对分子质量约为140000，是一种含Zn2+的金
属糖蛋白，由两个亚基组成。它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使
DNA或RNA的5′磷酸变为5′Oh末端。
CIp可在68℃10min内加热失活或通过酚抽提变性失活，而BAp则不
能。因为BAp对高温和去污剂的耐受性较强，故需要进行多次酚氯仿
抽提及凝胶电泳纯化DNA片段。此外，CIp的活性比BAp高10~20倍，所
以实验中一般选用CIp。碱性磷酸酶的主要用途有：
①5′末端标记前的处理；
②去除DNA片段的5′磷酸基团，防止自身连接。
在载体和目的基因的重组过程中，如果载体与外源DNA是使用同一
种限制性核酸内切酶消化的，则它们的连接产物有自身环化形式。为了
防止线性载体的自身环化作用，必须在连接之前使用碱性磷酸酶处理，去除其5′末端的磷酸基团。通过碱性磷酸酶预处理线性载体，有效防止
了载体的自身环化，提高了载体与外源DNA的连接效率，从而降低了细
菌转化时的背景。
本章小结
催化DNA各种特异性反应的酶是分子生物学家进行DNA操作的基
本工具。在分子克隆过程中，制备好目的DNA之后，下一步就是使用限
制性核酸内切酶将待克隆的DNA片段切割下来，与特异性切割的载体在
DNA连接酶作用下连接形成重组分子。这一系列操作不仅用到了限制性
核酸内切酶和DNA连接酶，而且还需要DNA聚合酶、核酸外切酶、多
核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶等的参与，以提高特异性DNA片段的连接效
率。由于以上各种酶类的发现，特别是限制性核酸内切酶和DNA连接酶
的应用，使不同分子之间的连接成为可能，而且分子克隆的方法不断创
新，基因克隆工作更加简单，应用范围更广。除了基因克隆外，其他研
究(如DNA的生化特性测定、基因的结构分析和基因表达调控研究
等)，也都要用到这些酶。可以说，几乎所有的DNA操作都离不开它
们。工具酶在基因工程中占据着极其重要的地位。
根据这些工具酶催化的反应类型，可将其分为四大类：
①核酸酶，用于切割或降解核酸分子；
②连接酶，可以把核酸分子连接起来；
③聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝；
④修饰酶，能够给核酸分子添加或去除核苷酸或某些化学基团。有
些酶兼有数种功能，如大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，除了能合成新的DNA
分子外，还有DNA外切降解作用。第6章 质粒载体
一个外源基因DNA进入细胞的几率非常低，在新的细胞内不能进行
复制和表达，原因主要是外源DNA不带有新细胞的复制系统，也不具备
宿主的功能表达调控系统，因此最终外源DNA会随着细胞分裂而丢失。
在基因克隆中，需要借助于一种运载工具，其携带外源基因进入宿主细
胞，并使外源基因持续稳定地复制表达，这种工具我们称之为载体
(vector)。
基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体等。载体的本质是DNA
复制子。目前使用得最多的载体是经过改造的质粒载体或噬菌体载体。
根据功能和用途不同，基因工程载体又可分为克隆载体、表达载体、测
序载体、穿梭载体等。克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁
殖的质粒载体，而表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外
源蛋白质的质粒载体。穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector)是指一类
由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的
宿主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以携带着外源
DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核细胞之间往返穿
梭，因此在基因工程研究工作中是十分有用的。常见的穿梭载体有大肠
杆菌土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体等。根据受体细胞不同，基因工程载体
又可分为原核生物载体、真核生物载体等。
作为基因工程的载体必须具备以下基本条件：
①具有复制子，能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。
②具有合适的限制性内切酶位点。在载体上每一种限制性核酸内切
酶的酶切位点最好是单一的，这样可以将不同限制性核酸内切酶切割后
的外源DNA片段准确地插入载体。
③具有合适的选择标记基因。最常用的标记基因是抗药性基因，如
抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素、抗卡那霉素等抗生素的抗性基
因。
④具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离
提纯。
⑤具有较小的相对分子质量，易于操作。
⑥具有较高的遗传稳定性。
在自然界中，质粒分布广泛，无论是真核生物细胞还是原核生物细
胞，都已经发现质粒的存在，它非常适合作为外源基因的载体在相应的
宿主细胞中复制、表达，是基因克隆操作中非常重要的工具。3.1.1质粒的基本特性
1.分子特性
质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。它广泛存在于细菌细
胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中
都发现有质粒的存在。质粒的大小从1kb到200kb以上不等。绝大多数质
粒都是双链闭合环状DNA分子。除了酵母的杀伤质粒(killer plasmid)
是一种RNA分子外，其他质粒都是DNA分子。
质粒DNA分子具有3种不同的构型：
①共价闭合环状DNA，其两条多核苷酸链均保持着完整的环状结
构，这样的DNA通常呈超螺旋构型，即SCDNA。
②开环DNA，其两条多核苷酸链只有一条保持着完整的环状结构，另一条链出现一至数个切口，此即OC构型。
③线形DNA，闭合环状DNA分子双链断裂成为线形DNA分子，此
即L构型。在体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶
电泳中，走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。
2.复制特性
根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或质粒在宿主细胞中拷贝数的
多少，可将质粒分成两种不同的复制类型：严紧型和松弛型。严紧型质
粒的复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，两者紧密相关，因此，质
粒在宿主细胞中拷贝数较少，一般只有1～3个拷贝。松弛型质粒的复制
受宿主的控制比较松，在宿主细胞中质粒拷贝数较多，一般有10～200
个拷贝，有时可达700个拷贝。因此，通常选用松弛型质粒作为基因工
程载体，以期获得高产量的重组质粒。
3.质粒的不亲和性
在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一个宿主细胞
系中稳定地共存的现象，称为质粒的不亲和性。原因可能是在细胞的增
殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉。质粒的不亲和性只有
在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的宿主细胞，在没
有选择压的情况下，这两种质粒不能长期稳定共存，在这种情况下认为
A和B是不亲和性质粒。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(incompatibility group)。
ColE1质粒和pMB1质粒及其派生质粒都是彼此不相容的，属于同一个不
亲和群。pSC101、F和Rp4质粒，它们归属于不同的不亲和群，所以这
些质粒或其派生的质粒载体，彼此能够在同一个细胞中稳定地共存。
4.质粒的转移性
质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。根据
质粒是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可将其分为接合型(conjugative)与非接合型(nonconjugative)两种。接合型质粒又叫自
我转移质粒，如F因子，其相对分子质量一般都较大，除了携带自主复
制所必需的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的
基因，因此能从一个细胞自我转移到另一个细胞中，它们多属于严紧型
质粒。非接合型质粒又叫不能自我转移质粒，如ColE1，其相对分子质
量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信息，但不携带控制细菌配对
和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞自我转移到另一个细胞
中。
从安全角度考虑，基因工程中所用的主要是非接合型质粒，这是因
为接合型质粒不仅能够从一个细胞转移到另一细胞，而且还能够转移染
色体。如果接合型质粒已经整合到细菌染色体的结构上，就会牵动染色
体发生高频率的转移。在基因工程中所用的非接合型质粒载体缺乏转移
所必需的mob基因，因此不能发生自我迁移。
3.1.2质粒载体的必备条件
一般没有经过体外修饰改造的质粒称为天然质粒。常见可用于基因
工程的天然质粒载体有pSC101、ColE1等。直接采用天然质粒用做载体
存在一些缺陷，因此限制了它在基因工程中的使用。最早用于基因克隆
的天然质粒是pSC101，其大小为9.09kb，是一个严紧型质粒。每个宿主
细胞中仅有1～2个拷贝，具有多个限制性核酸内切酶的单一酶切位点，但pSC101只有一个选择性标记Tetr，不能使用插入失活技术筛选重组
子。此外，pSC101的相对分子质量较大，克隆外源DNA的能力有限，拷贝数低，使得分离提取质粒DNA的工作难度大。
另一个天然质粒载体是ColE1，它的唯一单酶切位点EcoRⅠ位于大
肠杆菌素E1的编码基因内，插入外源基因后，引起插入失活，不能合成
大肠杆菌素E1，因此可以根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择重组子。
但ColE1的克隆位点有限，并且大肠杆菌素E1的免疫筛选，在实际应用
上比较麻烦。
一种理想的质粒载体一般应具备以下条件：
①具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数；
②具有多个单一的限制性核酸内切酶的酶切位点。基因工程中所使
用的载体一般有一个多克隆位点(multiple cloning site，MCS)。所谓
多克隆位点(或称多接头)，是指载体上人工合成的含有紧密排列的多
种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。它提供了各种各样可单独
或联合使用的克隆靶位点，以便克隆由多种限制性核酸内切酶中任意一
种或几种酶切割后产生的DNA片段。
③具有两种以上的选择标记基因。
④具有安全性。缺失mob基因后质粒就不会从一个细胞转移到另一个细胞中，减少了基因工程体扩散的危险性。
3.1.3常用的质粒载体类型
目前常用的克隆质粒载体有pBR322、pUC及其派生质粒载体。
pBR322质粒及其派生质粒具有较小的相对分子质量，可以克隆大到6kb
的外源DNA片段，具有两种选择标记，可利用氨苄青霉素和四环素来筛
选重组体，具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点，其中hindⅢ、BamhⅠ、SalⅠ、EcoRⅤ、SphⅠ的酶切位点位于Tetr中，pstⅠ的酶切
位点位于Ampr中，在这些位点克隆外源基因可利用插入失活法筛选重
组体。在宿主细胞内具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素处理扩增后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。
pUC系列的质粒载体通常是成对构建的，如pUC18pUC19，两者
的差别仅在于多克隆位点的方向相反。pUC系列的质粒载体除含有克隆
载体的一般元件以外，还包括大肠杆菌乳糖操纵子的β半乳糖苷酶基因
(lacZ)的启动子和β半乳糖苷酶氨基端头146个氨基酸片段的编码序
列，此结构特称为lacZ′基因，表达产生α肽；当无外源基因片段插入
时，质粒表达的α肽可与宿主菌上表达的β半乳糖苷酶的C端片段融为一
体，形成具有酶学活性的β半乳糖苷酶，产生lacZ+表型，实现了基因内
互补，这种互补现象叫做α互补。
具有酶学活性的β半乳糖苷酶在诱导物异丙基βD硫代半乳糖苷
(IpTG)存在时，可以将生色底物5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(Xgal)分
解，形成蓝色产物，在平板上形成蓝色的菌落。当多克隆位点中插入外
源DNA片段时，α互补作用遭到破坏，在含有IpTG和Xgal的平板上将出
现白色菌落。这种方法又称α筛选。当然，当插入的DNA片段较小，不
破坏α肽的读码框时，重组子菌落可表现出浅蓝色。
在pBR322基础上构建的pUC质粒载体，仅保留了氨苄青霉素抗性
基因和复制起点，相对分子质量更小，如pUC8pUC9为2750bp，pUC18pUC19为2686bp，而且利用组织化学法筛选重组体，更方便省
时。因此，pUC系列质粒是目前最广泛使用的质粒载体。
pGEM系列质粒载体就是一类多功能载体，如pGEM3、pGEM4、pGEM3Z、pGEM4Z、pSp64、pSp65、pGEM3Zf等，都是由pUC系列质
粒载体派生而来的，含有T7及Sp6RNA聚合酶的启动子及转录起始位
点，它们分别位于lacZ′基因中多克隆位点的两侧，故在体外能转录出相
应的mRNA。因为该质粒还具有Lac启动子调控区及α肽编码区，噬菌体
F1的复制起始区以及正、反向序列分析引物的结合位点，所以能进行测
序操作。
pBV221表达载体是我国科学家构建的胞内表达载体，其表达产物
位于细胞质中。它利用λ噬菌体的pL、pR作为串联启动子，一个温度敏感的转录阻遏蛋白基因cI857位于其上游；在多克隆位点的下游区有一
强转录终止序列rrnB；在多克隆位点与启动子之间有SD序列。cI857阻
遏蛋白是一个温度敏感的转录调控蛋白，在30℃时其与启动子紧密结
合，阻止转录起始；当培养温度升到42℃时，阳遏蛋白失活并从启动子
上解离，RNA聚合酶与启动子结合而起始转录，这种可诱导的启动子使
得基因能高效表达。
pTA1529是分泌型表达载体，在启动子之后有一信号肽编码序列。
外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点，使外源基因的第一个密码子
正好与信号肽最后一个密码子相接。外源基因连同信号肽基因一起转
录，然后翻译成带有信号肽的外源蛋白。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌
细胞膜与细胞外壁之间的周质时，信号肽被信号肽酶所切割，得到成熟
的外源蛋白。pTA1529由大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因启动子(phoA)及
其信号肽(由21个氨基酸组成)基因构建而成。在磷酸盐饥饿的状态
下，外源蛋白得以表达并分泌到细胞周质中。大肠杆菌中常用介导分泌
的信号肽除phoA的信号肽外，还有大肠杆菌外膜蛋白(Omp)类的信
号肽等。
根据复制模式，可将酵母的质粒分成5种不同的类型：YIp、YRp、YCp、YEp和YLp。其中，除了线性质粒YLp之外，全能与大肠杆菌质
粒构成穿梭载体。在动物体系中也已经发展出类似的穿梭质粒载体，最
早是由大肠杆菌质粒载体和牛乳头状瘤病毒(bovine papilloma virus，BpV)构建而成的。例如，pBpVBV1就是一种典型的动物细胞系统穿梭
质粒载体，它既可在大肠杆菌细胞中复制，亦可在动物细胞中复制。但
是，目前还没有发展出适用的大肠杆菌植物细胞穿梭质粒载体。第7章 λ噬菌体载体
细菌质粒载体为基因克隆提供了方便，但是其克隆容量仅在10kb左
右，不能满足诸如构建基因组文库等的要求。因为需要找到一种克隆容
量更大的载体，λ噬菌体载体便应运而生。
3.2.1λ噬菌体的生物学特性
λ噬菌体由一个包裹着DNA的正二十面体的蛋白质头部和一个中空
管状的蛋白质尾部组成，属温和噬菌体。当它感染大肠杆菌时，尾部吸
附在大肠杆菌细胞壁上，头部中的DNA经尾部注入到细菌细胞中，蛋白
质外壳留在细菌细胞外面。噬菌体DNA进入细菌细胞内后，可有溶菌周
期和溶原性周期两种生活周期。在溶菌周期中，λ噬菌体的DNA分子便
可借助宿主的复制和转录系统进行复制和外壳蛋白合成，同时两者组装
成完整的噬菌体颗粒，20min后就可使宿主细胞发生裂解，释放出大约
100个噬菌体颗粒。在溶原性周期中，λ噬菌体的DNA分子并不马上复
制，而是在特定的位点整合到宿主染色体DNA中，与宿主染色体形成一
体，并随宿主染色体的复制而复制，随宿主的分裂繁殖而传给其子代细
胞。但这种潜伏的λ噬菌体DNA在某种营养条件或环境条件胁迫下，可
以从宿主染色体DNA上切割出来，并进入溶菌周期。
λ噬菌体基因组是一条线性双链DNA分子，大小为48502bp，其上有
12个碱基的单链互补黏性末端，当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过
黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双
链区段称为cos位点(cohesiveend site)。这是将λDNA包装到噬菌体
颗粒中所必需的DNA序列。
λ噬菌体基因组分为3个区域：
①左侧区，自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。
②中间区，介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬
菌斑形成无关，被外源DNA片段取代后，并不影响噬菌体的生命活动。
中间区包含重组基因和一整合切割基因。
③右侧区，位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基
因和裂解基因。
在裂解周期的早期，环状的λDNA分子按θ型进行双向复制，到了晚
期，控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变成滚环型复制，合
成出由一系列λDNA线性排列的多聚体分子。线性的λDNA多聚体分子
不能被包装进头部，必须经过核酸酶的切割作用，从cos位点将它分成
单位长度的单体分子，才能够被包装起来。cos位点是λ噬菌体正确包装
的必需位点。
在溶原性周期，λDNA稳定地整合到宿主染色体上并随之一起复制。在进行这种复制时，只有CI基因得以表达，合成出一种可以使参与
溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。
3.2.2常见的λ噬菌体载体的构建
野生型的λ噬菌体DNA基因组大而复杂，不适于直接用作基因克隆
的载体，而且λ噬菌体外壳只能接纳一定长度(即相当于野生型λ基因组
大小的75%～105%)的DNA分子。因此必须对野生型λDNA进行改
造。
根据理想基因工程载体的条件，并针对野生型λ噬菌体作为基因工
程载体的缺陷，对λDNA进行了以下几方面的改造：
①切除掉λDNA的非必需区段，扩充λ噬菌体载体的克隆容量；
②除去λDNA必需区段中的限制性核酸内切酶识别位点，在非必需
区引入合适的限制性核酸内切酶位点；
③引入适当的选择性标记以方便重组子的筛选；
④通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于
生物学防护等。
早期构建的λ噬菌体载体有插入型和取代型两种不同的类型：只具
有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生
载体，称为插入型载体，如λgt10、λgt11、λBV2、λNM540、λNM1590、λNM607等。具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们
之间的DNA区段可被外源DNA片段所取代，这类λ噬菌体派生载体称为
取代型载体(或称置换型载体)，如Charon4、Charon10、Charon35、λgtWES、λEMBL3等。这两种载体特点不同，用途也不尽相同。插入型
载体只能承载较小的外源DNA片段，一般在10kb以内，广泛应用于
cDNA及小片段DNA的克隆；对于取代型载体，除去中间填充片段，其
左右两臂通过融合所形成的基因组如果太短，就无法包装成有侵染力的
噬菌体；只有当一定大小的外源DNA片段插入之后，才能包装成有侵染
力的噬菌体，并形成噬菌斑。由此可见，这种载体对重组噬菌体有正向
选择作用。
取代型载体可承载20kb左右的外源DNA片段，常用来克隆高等真核
生物的染色体DNA。随着多克隆位点技术的应用，现在常规使用的λ噬
菌体载体都带有多克隆位点，其中许多既可用作插入型又可用作取代
型。
3.2.3常见的λ噬菌体载体
在λ噬菌体载体的非必需区段插入LacZ′基因，其中带有多克隆位
点，如λgt11、λgt18~23等，它们在生色底物(Xgal)和诱导物(IpTG)
存在时，与相应的Lac—宿主通过α互补作用在平板上可形成深蓝色噬菌
斑。如果β半乳糖苷酶基因被外源DNA片段插入失活，所产生的重组噬菌体丧失α互补能力，则在含有Xgal和IpTG的平板上形成无色噬菌斑。
因此，对于这类λ噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛
选。这类载体有λgt11、λgt18~23、Charon2等，都含有lacZ′基因，其上
具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点，可用组织化学法筛选重组
体。
噬菌体434是λ噬菌体家族的成员之一，它的免疫区段(imm434)
具有EcoRⅠ和hindⅢ两种限制性核酸内切酶的单切位点，当由这些位点
插入外源DNA片段时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到
破坏。因此，凡带有外源DNA片段的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而
没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，所以不同的噬菌斑形态
可作为筛选重组体的标志。科学工作者通过噬菌体杂交的办法，已经将
imm434免疫区段导入λ噬菌体基因组，构建成许多免疫功能失活的插入
型载体。这类常用的载体有λgt10、λNM1149及Charon6、Charon7等，可根据噬菌斑的形态筛选重组体。
Charon系列取代型载体专门设计用来克隆大片段DNA，常用的有
Charon32～35、Charon40、Charon21A等。Charon34的中间填充片段为
16.4kb的大肠杆菌DNA的BamhⅠ片段，Charon35的中间填充片段为
15.6kb的大肠杆菌DNA的BamhⅠ片段，它们在填充片段的两侧都有一
个反向的多克隆位点。
λEMBL系列取代型载体也是用来克隆DNA大片段的，常用的载体
有λEMBL3、λEMBL4、λEMBL3A等。λEMBL4的中间填充片段为
13.2kb，其两侧为限制性核酸内切酶的单切位点。λEMBL3A是在
λEMBL3的基础上使A基因发生琥珀突变而构建的。第8章 单链DNA噬菌体载体
单链DNA噬菌体载体主要是由M13噬菌体构建发展起来的一类载
体。它们具有其他载体所不具备的优越性：
①它们不存在包装限制问题，已成功地包装了总长度为M13DNA6
倍的DNA分子，能克隆较大的DNA片段。
②可从噬菌体颗粒中产生大量含有外源DNA序列的单链DNA分
子。这种重组体单链DNA分子在基因定点突变、DNA序列测定、杂交
探针制备中特别有用。
③应用这类载体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入方向。
④可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA，如同质粒一样，能在体
外进行基因克隆操作。⑤其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大
肠杆菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。因此，它们在基因工程中
具有特别重要的作用，越来越受到人们的重视。
3.3.1M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体含有一个6.4kb的单链闭环DNA分子，外形呈丝状，大
小为900nm×9nm，这条感染性的单链DNA称为M13噬菌体的正链
DNA[(+)DNA]。M13噬菌体基因组的90%以上是编码蛋白质基
因，M13噬菌体并不像λ噬菌体那样存在插入外源DNA的非必需区域。
M13噬菌体在感染大肠杆菌时通过性纤毛进入宿主细胞内，故其只
能感染大肠杆菌雄性菌株。M13噬菌体的繁殖并不会导致宿主细胞发生
溶菌现象，感染的细胞能够继续生长和分裂，一般认为，M13噬菌体首
先吸附在性纤毛的末端，然后外壳蛋白脱落，(+)DNA在附于其上的
基因Ⅲ编码蛋白的引导下，进入大肠杆菌细胞内。在宿主细胞内复制酶
的作用下，以(+)DNA为模板，合成其互补的(—)DNA，形成双链
DNA，称为复制型DNA(replication form DNA，RFDNA)，它按θ形式
进行DNA复制。当在宿主细胞内积累约200个RFDNA分子后，M13噬菌
体的基因Ⅱ产物便在RFDNA的正链特定位点上作用，产生一个切口，正式开始M13基因组的复制。其基本特点是利用大肠杆菌DNA聚合酶
Ⅰ，以(—)DNA为模板按滚环方式合成(+)DNA，复制叉每环绕负
链整整一周时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切除下去，经环化后形成单
位长度的M13噬菌体基因组DNA。这种滚环复制是不对称的，因为基因
Ⅴ编码的单链特异结合蛋白，与(+)DNA结合，阻断(—)DNA的合
成。新产生的游离(+)DNA按一种特异方式包装成噬菌体颗粒。这时
与基因Ⅴ产物形成DNA蛋白质复合物的(+)DNA转移到细胞膜上，同
时基因Ⅴ蛋白从(+)DNA上脱落下来，(+)DNA从宿主细胞膜上溢
出，并在此过程中被外壳蛋白质包装成噬菌体颗粒。这种包装方式不需要预先形成固定结构，被包装的单链DNA大小不像λ噬菌体那样有严格
的限制，因此M13噬菌体载体具有较大克隆能力。
3.3.2常见的M13噬菌体载体
大多数M13噬菌体载体都是成对构建的，例如M13mp8
M13mp9、M13mp10M13mp11、M13mp18M13mp19等，它们之间
的区别在于相同的多克隆位点取向相反。M13mp1是构建的第一个M13
噬菌体载体，随后构建的一系列M13载体都是在此基础上经改建派生出
来的。例如M13mp2、M13mp3、M13mp7～11及M13mp18和M13mp19
等，其中M13mp18和M13mp19是目前最常用的M13噬菌体载体。
M13mp8～11及M13mp18和M13mp19等的多克隆位点是非对称排列
的，对某一限制性核酸内切酶只有单一酶切位点。因此，可用来克隆具
有不同限制末端的外源DNA片段，而且克隆片段插入的方向是固定的。
M13噬菌体载体的主要用途：第一，可以制备单链DNA进行DNA
序列分析，例如可以用一个引物(通用引物)，从两个相反的方向，同
时测定同一个外源DNA片段双链的核苷酸顺序，获得彼此重叠又相互印
证的DNA序列结构资料。第二，可以制备只与外源DNA的任意一条链
互补的DNA探针。第三，可以在寡核苷酸介导的基因定点突变中用来制
备含有目的基因的单链DNA模板。
M13噬菌体载体也存在不足，插入的外源DNA片段不稳定，片段越
大，越容易发生缺失或重排。一般情况下其有效的最大克隆能力仅
1.5kb。理论上，M13噬菌体载体克隆外源DNA片段有两种插入方向，但实际上外源DNA总是按一种主要的方向插入的。
3.4噬菌粒载体
噬菌粒载体(phagemid vector，phasmid vector)集质粒和丝状噬菌
体载体的长处于一体，具有很大的优越性：
①分子较小，约为3kb，可克隆10kb的外源DNA片段。
②由于它们既具有质粒的复制起始点，又具有M13噬菌体的复制起
点，因此在宿主细胞内可按质粒双链DNA分子形式复制，形成的双链
DNA既稳定又高产。当辅助噬菌体存在时，复制按M13噬菌体的滚环复
制模型进行复制，产生单链DNA分子。
③具有多种功能，用一个噬菌粒载体可以进行多种多样的工作，例
如，外源DNA片段的克隆、产生单链模板DNA用于基因定点突变、直
接测定插入的外源DNA片段的序列、对外源基因进行体外转录和翻译
等。
pUC118和pUC119噬菌粒载体是把含有M13噬菌体复制起点的476bp
长的片段分别插入到pUC18和pUC19质粒载体的NdeⅠ位点上构建而成
的。除了多克隆位点的取向相反外，两者的分子结构完全一样，都含有Ampr选择标记和乳糖操纵子的调控序列及α肽编码区，因此，可利用氨
苄青霉素和组织化学法筛选重组子。此外，在多克隆位点的两侧具有T7
噬菌体RNA聚合酶启动子，可进行体外转录。
3.5黏粒载体
λ噬菌体载体克隆外源DNA的能力，虽然理论上的极限值可达
24kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。而许多真核基因的
大小比通常预期的要大得多，有的可达35～45kb，甚至更大。因此，为
了克隆和增殖真核基因组DNA大片段，科学工作者设计并构建了一类具
有较大克隆能力的新型克隆载体——黏粒载体(cosmid vector)，又称
柯斯质粒载体。黏粒载体是一类含有λ噬菌体的COS序列的质粒载体。
3.5.1黏粒载体的基本特点
1.具有λ噬菌体的体外包装、高效感染等特性
黏粒载体本身不能在体外被包装成噬菌体颗粒，只有在克隆了合适
长度的外源DNA片段后才能被包装成噬菌体颗粒，因此，它具有正选择
重组子的作用。这种噬菌体颗粒可以高效感染对λ噬菌体敏感的大肠杆
菌细胞。黏粒载体的重组子DNA分子进入宿主细胞后，便按照λ噬菌体
同样的方式环化起来。但黏粒载体并不含有λ噬菌体的全部必需基因，因此它不能够形成子代噬菌体颗粒。
2.具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性
黏粒载体具有质粒的复制起点，在宿主细胞内像质粒DNA一样进行
复制，并且在氯霉素作用下可进一步扩增。黏粒载体通常具有抗菌素抗
性选择标记，其中有一些还带有引起插入失活的克隆位点。此外，黏粒
载体的相对分子质量较小，易于克隆操作。
3.具有高容量的克隆能力
黏粒载体的分子较小，一般为5～10kb。按λ噬菌体的包装限制(38
～52kb)，黏粒载体的平均最大克隆容量约为42kb(28～50kb)，平均
最低克隆容量约为33kb(11～34kb)。由此可见，黏粒载体用于克隆
DNA大片段特别有效。
4.具有与同源序列的质粒进行重组的能力
当黏粒载体与一种带有同源序列的质粒共存于同一个宿主细胞中
时，它们之间便会通过同源重组形成共合体。
3.5.2黏粒载体的构建
应用黏粒载体构建基因组文库所遇到的最大问题是黏粒载体经过酶
切产生的线性DNA片段彼此之间会首尾相连形成多聚体分子；其次是酶
切的基因组DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片
段随机再连接，串联地插入到载体上，而它们的结合顺序并不符合在真
核基因中的固有排列顺序。因此，使用含有这种插入片段的克隆作DNA序列分析，所得出的染色体结构将是错误的。除了用克隆方法解决此问
题外，还通过对黏粒载体进行改良，设计并构建了一些新颖的黏粒载体
来解决此问题。例如，使用仅含有一个cos位点的黏粒载体进行克隆实
验，需要经过碱性磷酸酶的脱磷酸处理和凝胶电泳纯化等烦琐的操作程
序，其结果使得载体双臂DNA的最终获得率极低，为此，Bates和
Swift(1983)构建了一种具有两个cos位点的黏粒载体——c2XB。这个
载体具有BamhⅠ单克隆位点，产生平头末端的SmaⅠ限制性核酸内切酶
的酶切位点位于两个cos位点之间。因此，载体经双酶切后，得到中间
具有一个cos位点、两端分别为平头末端(SmaⅠ)和黏性末端
(BamhⅠ)的载体双臂DNA片段，这样有效地阻止了载体双臂DNA片
段自我连接形成多聚体分子，从而提高了克隆效率，降低了假阳性的比
例。
3.5.3黏粒载体在基因克隆中的应用
应用黏粒载体克隆真核基因组DNA大片段的技术，称为黏粒克隆
(cosmid cloning)。它的一般程序是：先用特定的限制性核酸内切酶局
部消化真核生物的DNA，产生出高相对分子质量的外源DNA片段，与
经同样的限制性核酸内切酶切割过的黏粒载体线性DNA分子进行体外连
接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一
个cos位点、中间为长度40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点
在取向上是一样的。这种分子与在λ噬菌体感染晚期所产生的分子是类
似的。因此，当加入λ噬菌体的包装连接物时，它将能识别并切割这种
两端各由一个cos位点包围着的35~45kb长的真核DNA片段的重组分子，并把这些分子包装进λ噬菌体的头部。当然，由包装形成的含有这种
DNA片段的λ噬菌体头部是不能够作为噬菌体生存的，但它们可以用来
感染大肠杆菌。感染之后，注入细胞内的这种重组分子便通过cos位点
环化起来，并按质粒分子的方式进行复制和表达其抗药性选择标记。
黏粒克隆存在技术上的两大缺陷。为此，一般都在连接反应之前，先用碱性磷酸酶对线性的黏粒载体DNA做预处理，使之脱磷酸，以阻止
它们之间发生自我连接作用。另一比较有效的办法是，在进行连接反应
之前，先将局部消化产物通过凝胶电泳做大小分级分离，然后将长度在
31~45kb范围的DNA片段再与线性化的黏粒载体DNA进行连接。然而，即使经过了这样的处理，在实际的黏粒克隆中，也依然会出现一些由原
来彼此不相邻的两条DNA片段连接形成的串联插入。因此，人们从克隆
方法和构建的一些新颖的黏粒载体的基础上，设计了特殊的克隆方案，解决了黏粒克隆中存在的技术难点。
3.5.4常用的黏粒载体及应用
在基因工程中常用的黏粒载体有：pJt38、c2XB、phC79、pcosEMBL、pWE15、pWE16、Charomid系列等。pJB8这个黏粒载体的
最大特点是在克隆位点BamhⅠ的两侧，各有一个EcoRⅠ酶切位点，因
此，可用EcoRⅠ切割，从重组体分子中重新获得插入的DNA片段，它
带有氨苄青霉素抗性选择标记，其克隆能力为31~47kb。
黏粒载体的主要优点是克隆容量大，转化率高。因此，它主要用于
真核生物的基因组文库构建。这样，不仅可以减少基因组文库的克隆
数，大大减少工作量，而且可以提高筛选时阳性克隆的检出率(包装正
选择等)。尽管黏粒克隆的技术困难已基本得到解决，但由于λ噬菌体
载体具有多功能性和较高的克隆效率，因此，λ噬菌体载体仍然是目前
构建基因组文库时首选的克隆载体。黏粒载体只有在以下两种特定的情
况下使用：
①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；
②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段。总之，在克隆大
容量目的基因时使用黏粒载体具有明显的优势。第9章 人工染色体
3.6.1酵母人工染色体
由于许多真核基因过于庞大，特别是人类基因组计划、水稻基因组
计划需要能克隆更长DNA片段的载体，于是一系列人工染色体
(artificial chromosome)应研究需要而产生。酵母人工染色体(YAC)
是目前能克隆最大DNA片段的载体，可插入100～2000kb的外源DNA片
段。YAC是由酵母的自主复制序列(autonomously replicating
sequence，ARS)、着丝粒(centromere，CEN)、四膜虫的端粒
(telomere，TEL)以及酵母选择性标记组成的能自我复制的酵母线性
克隆载体。着丝粒主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到各子细胞
中；端粒位于染色体末端，对于染色体的稳定及端粒复制具有重要意
义；自主复制序列即染色体上DNA复制的起始位点。首先构建两臂，左
臂含有端粒、酵母筛选标记Trpl、自主复制序列ARS和着丝粒，右臂含
有酵母筛选标记Ura3和端粒，然后在两臂之间插入DNA大片段，从而构
建成酵母人工染色体。
YAC虽然可容纳较长的DNA片段，但是用其克隆外源基因易出现
嵌合体和不稳定现象，而且YAC克隆不容易与酵母自身染色体
(15Mb)相分离。
3.6.2细菌人工染色体
细菌人工染色体(BAC)是以细菌F因子(细菌的性质粒)为基础
构建的细菌克隆载体。BAC除去了F因子的转移区及整合区等复制非必
需区段，并引入多克隆位点及选择标记。BAC克隆容量可以达300kb，重组DNA比较稳定，比YAC易分离，但是拷贝数低。
3.6.3哺乳动物人工染色体
如果能从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒，就
可以构建成哺乳动物人工染色体(MAC)，它可以克隆大于1000kb的
外源DNA片断。MAC有广泛的应用领域，可以研究哺乳类细胞中染色
体的功能。MAC也可以用于体细胞基因治疗，原因是由于MAC能在宿
主细胞中自主复制，可以将整套的基因，甚至将有一串与特定遗传病有
关的基因及其表达调控序列转入受体细胞中，不会将DNA插入到病人基
因组而引起插入突变，使基因治疗变得更有效。
3.7植物基因工程载体
理想的植物基因工程载体要求其相对分子质量不能太大，能携带外
源DNA进入植物细胞并整合到基因组中，插入较大的外源DNA片段而
不影响其复制和转化细胞的能力；具有选择标记，能有效地筛选转基因
植株等特点。3.7.1质粒转化载体
Ti质粒是从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中分离出来的
一种肿瘤诱导质粒。Ri质粒是从发根农杆菌(Agrobacterium
rhizogenes)中分离出来的一种毛状根诱导基因。根癌农杆菌和发根农
杆菌是两种宿主非常广泛的土壤细菌，在自然状态下它们能通过伤口侵
染植物，分别导致冠瘿瘤和毛状根的发生。Ti质粒和Ri质粒上含有
TDNA区段，TDNA能够高频率插入植物基因组中。将外源基因插入到
TDNA中，外源基因可以随着TDNA整合到植物基因组中从而实现基因
的转移。因此，Ti质粒和Ri质粒是植物基因工程最理想的转化载体。
3.7.2植物病毒转化载体
植物病毒种类繁多，在已知的300多种植物病毒中有大约91%为单
链RNA病毒。病毒侵染植物细胞后，病毒的DNA或RNA能自发地进行
基因转移，并且在植物细胞中复制和表达。因此，植物病毒可以作为植
物的基因转化载体。
迄今为止所知的双链DNA病毒只有花椰菜花叶病毒组和黄瓜黄脉病
毒组。其中花椰菜花叶病毒(CaMV)的性质、功能、基因组结构是研
究得轻清楚的，被认为是病毒转化载体的最佳候选者。
花椰菜花叶病毒(CaMV)是一种双链DNA病毒，目前发现12bp的
外源小片段可以在CaMV的四个区域插入：编码区Ⅱ，也称基因Ⅱ或
OrfⅡ；编码区Ⅰ和Ⅵ之间的大间隔区；编码区Ⅳ的C末端区域和编码区
Ⅵ区域。研究发现，当插入500bp的较大片段时，大部分CaMV就丢失
了DNA,从CaMV的插入外源DNA限制来看，这种植物基因转化载体还
需要进一步改进。
单链DNA病毒又称为双联体病毒或孪生病毒(GeNV)，感染范围
较广，包括双子叶植物和单子叶植物，其传播媒介是昆虫。该病毒由两
个连接在一起的病毒颗粒组成，其大小18～20nm，含有1～2个长为2.5
～3.0kb的单链环状DNA分子。例如菜豆金花叶病毒(BGMV)、番茄
金花叶病毒(TGMY)含有感染所必需的两个单链环状DNA分子，小麦
矮化病毒(WDV)含有一个单链环状DNA分子。
在双子叶植物中，TGMV的衣壳蛋白基因被NptⅡ和Cat取代，并得
到复制和表达，进一步说明GeNV是一种很有前景的转化载体。
烟草脆裂病毒(TRV)是一种单链RNA病毒，TRV基因组由两段独
立的RNA组成，每一段都包装成棒状的病毒颗粒。其中较长的一段
RNA因为不含有衣壳蛋白的编码序列，所以单独存在时只能产生不包装
RNA分子。较短的RNA编码衣壳蛋白，但其复制必须有较长RNA的存
在才能进行。利用这两种病毒颗粒共同感染植物，可以使病毒基因组得
到正常的复制和表达。一般认为，利用RNA病毒作为转化载体首先单链的病毒RNA在反转录酶的作用下反转录成一条单链的cDNA，然后单链
cDNA在DNA聚合酶的作用下形成双链cDNA，通过重组技术cDNA双链
插入到克隆质粒中，使在克隆质粒中的病毒cDNA连同外源基因先转录
成RNA转录体，再用此来感染植物。
3.8动物基因工程载体
将外源基因转入动物细胞，通常应用由动物病毒构建的一类载体。
病毒具备异常有效的入侵细胞的能力，因此它是功能强大的基因转移载
体。例如SV40病毒载体、杆状病毒载体在动物基因工程中已愈来愈普
遍地应用。但是在构建病毒载体时，因为病毒本身的致病性，所以往往
利用致病力弱的动物病毒或某些病毒的弱毒株进行改造，构建成基因载
体。
动物病毒侵入动物细胞后，呈现裂解感染和整合性感染两种生长状
态。裂解感染是依靠宿主细胞的酶和调控系统合成病毒核酸和结构蛋
白，病毒DNA大量复制，在感染的细胞内有着大量的病毒DNA拷贝，病毒在细胞内装配成完整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，感染细胞则大多数因代谢障碍而死亡。整合性感染是病毒核酸整合到细
胞染色体中，随着细胞DNA的复制而扩增。病毒DNA的序列中往往具
有几个很强的启动子，它可使排列在其后方的基因高效表达。如果将外
源基因插入在病毒DNA强启动子的后方，那么随病毒DNA在细胞内大
量复制的同时，也将得到外源基因的高效表达。
3.8.1SV40病毒载体
SV40是一种猿猴空泡病毒，环状双链DNA分子，全长5241bp。根
据基因组内转录的时间顺序和方向，分为两个转录区域，即早期转录区
和晚期转录区。当它感染猿猴细胞时，其DNA进入细胞核后，开始依次
进行早期转录、DNA复制、晚期转录。在早期转录中产生T抗原和t抗
原。当细胞内T抗原和t抗原积累到足够时，T抗原启动DNA复制，并启
动顺时针方向的转录。在晚期转录中，产生病毒外壳蛋白Vp1、Vp2、Vp3，并与新复制的病毒DNA装配成病毒颗粒，细胞内病毒颗粒达到
105个时，细胞破裂，释放出病毒颗粒。此过程称为裂解感染，这种敏
感细胞称为受纳细胞。当SV40感染啮齿动物细胞时，DNA整合到宿主
细胞的染色体DNA上，随染色体DNA复制而复制，不会使细胞破裂，最终导致细胞癌变，不产生病毒颗粒，这个过程称为非裂解感染，这类
细胞是非受纳细胞。SV40致瘤的原因主要是其基因组整合入宿主基因
组，可以整合病毒基因组的某些片段，也可以整合10拷贝以上的病毒基
因组；但至今人们对整合机制还不清楚。
SV40病毒基因组中，早期区域和晚期区域是相对独立的转录单
元，因此可以有晚期区被取代和早期区被取代两种类型的取代型载体。SV40颗粒包装对分子大小有严格限制，构建载体只能是取代型的，被
取代的DNA不能超过基因组全长的30%。
对于晚期区取代型载体，由于缺失晚期区域，不能将重组DNA包装
成新的病毒颗粒，因此这样的克隆载体必须与辅助病毒一起感染受体细
胞。辅助病毒是一种不产生T抗原，但能产生外壳蛋白的突变体。在受
体细胞内，依赖辅助病毒产生的外壳蛋白，重组DNA包装进新的病毒颗
粒。
对于早期转录区取代型载体，由于缺失早期区域，不能产生T抗
原，缺失复制功能，必须具有T抗原互补功能的辅助病毒，或者建立含
SV40早期转录区的辅助细胞系(如COS、hFS细胞系)。一般用后者把
SV40早期转录区DNA序列整合到敏感动物细胞基因组中，使其有效表
达T抗原。当早期区DNA序列被外源DNA取代的重组SV40DNA导入这
种细胞时，T抗原得到互补，重组SV40DNA能进行有效复制。
3.8.2反转录病毒载体
反转录病毒又称逆转录病毒，是一类RNA病毒。该类病毒大多数具
有致瘤性，故又称为RNA肿瘤病毒。其基因组RNA进入宿主细胞后通
过自身编码的反转录酶合成双链DNA，这种DNA能随机整合到宿主细
胞基因组中，随宿主细胞基因组一起复制或转录，转录产生的正链RNA
可以装配成病毒颗粒，也可以不发生装配，成为病毒蛋白合成的模板。
反转录病毒的基因组为两条相同的单链RNA组成的二聚体，通常长
为8～10kb，其两端含有相同的结构，即长末端重复序列(long terminal
repeat，LTR)，其长度为几百个碱基。逆转录病毒能在宿主细胞中永
久性地表达外源基因，具有构建载体的良好特性。此外，它能感染几乎
所有类型的细胞，受体细胞的范围广泛。
反转录病毒载体的类型，早期构建的多为单基因载体，是以单个外
源基因取代反转录病毒的反式作用序列。由于这种载体的外源基因表达
只受LTR中病毒的唯一启动子调控，因而应用受到局限。后来构建的并
被广泛应用的是多基因载体，例如双表达载体、自灭活载体、自分解载
体等。双表达载体保留了大部分的病毒顺式作用序列。病毒载体携带2
个外源基因，均处于5′端LTR中启动子的控制下，这种载体的特点是提
供了病毒基因转移、表达的顺式作用序列，即5′端LTR中的启动子、增
强子、3′端LTR中的多聚A信号和内含子剪切位点。但是转移的基因只
在病毒启动子有活性的细胞中才能表达。自灭活载体通过缺失LTR中的
部分启动子和增强子，产生的自灭活载体在感染宿主细胞后形成的前病
毒DNA不能进行转录，外源基因由自身融合的启动子控制表达，因而不
会发生插入激活作用。此类载体的特点是比较安全，但不足之处是大多
数载体产生病毒感染的滴度较低，不能进行有效的基因转移。自分解载体含有反转录病毒的内部附着序列，病毒基因组的结构不完整，病毒复
制两次后前病毒DNA整合到宿主基因组中，外源基因的内部启动子控制
进行特异的表达。此种载体不能产生复制性病毒粒子，因而也是一种安
全的反转录病毒载体。
以反转录病毒作载体进行基因转移具有基因转移效率高、病毒感染
力强等优点，而且反转录病毒有广泛的宿主范围，不仅适用于单层细
胞，也适用于悬浮培养的淋巴细胞、前髓细胞及造血干细胞等多种骨髓
来源的细胞；经特殊构建的反转录病毒载体是缺陷型，不易产生感染性
病毒粒子，比较安全。不过，有的反转录病毒载体可能具有潜在激活癌
基因的作用。
3.8.3痘苗病毒载体
痘苗病毒的基因组是一个线性双链DNA，长约185kb，其中有一个
28kb的区域是病毒复制的非必需区，可以被外源基因取代。痘苗病毒能
在宿主的细胞质中独立地复制和转录，高度稳定，宿主范围广，因此，可以作为良好的载体。痘苗病毒载体的构建需要采用同源重组的方法。
重组痘苗病毒表达外源基因，需要在基因两端组装上胸腺嘧啶核苷激酶
的tk基因或ha基因同源重组，将外源基因整合到痘苗病毒基因组上。痘
苗病毒载体通常具有三个主要成分：痘苗病毒的调控序列、胸腺嘧啶核
苷激酶基因(tk基因)以及位于tk基因中供外源基因插入的克隆位点，利用tk基因插入失活作为选择标记。
痘苗病毒载体的主要用途是构建痘苗病毒活疫苗。迄今为止，用痘
苗病毒载体表达的外源基因有：乙型肝炎表面抗原基因、流感病毒血凝
素基因、狂犬病毒表面糖蛋白基因，以及单纯疱疹病毒、EB病毒、水
泡性口炎病毒、伪狂犬病毒和疟原虫等的抗原基因。
3.8.4腺病毒载体
腺病毒是一种二十面体的颗粒线状双链DNA病毒，其基因组大小为
32~36kb，分为哺乳动物和禽类两个属。在线性DNA两端各存在1个含
103~162bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，因此
变性后的两条链可能分开成单链，彼此形成一个茎环结构。ITR为病毒
DNA复制的起始位点。
野生型腺病毒容纳外源DNA的最大容量为2kb。如果将病毒的非必
要区域删去，用外源DNA取代，可以增加病毒接受外源DNA的容量，又不影响重组病毒的复制和包装。理论上，基因组除了两端各约500bp
的序列结构是复制和包装所必需的，其他部分均可以被外源DNA取代。
人腺病毒具有易感染性，宿主范围广，而且外源DNA不会整合到宿主染
色体上，具有较高的安全性，已成为较有前途的基因转移载体之一。
腺病毒载体在转移和表达外源基因方面具有许多优点：①其基因组较小，易于操作；②有多个外源基因插入位点；③腺病毒DNA不整合到
宿主染色体上，不会引起插入突变；④腺病毒致病性小，重组腺病毒结
构稳定；⑤重组病毒滴度高。
本章小结
基因工程载体是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载
工具”，它的本质是DNA复制子。作为基因工程载体必须具备3个基本条
件：
①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。
②具有合适的限制性核酸内切酶位点。
③具有合适的选择标记基因。使用最多的基因工程载体是质粒载体
和噬菌体载体。
质粒载体主要有克隆质粒载体、表达质粒载体、穿梭质粒载体等。
常用的克隆质粒载体是pBR322及pUC系列。噬菌体载体主要有λ噬菌体
载体和M13噬菌体载体。它们的克隆容量大于质粒载体，用于基因文库
的构建。插入型λ噬菌体载体的克隆容量小于取代型λ噬菌体载体，前者
只能克隆10kb以下的外源DNA片段，后者可克隆20kb左右的外源DNA
片段。M13噬菌体载体在制备单链DNA中有重要用途。黏粒载体是一类
含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体，它的克隆容量较大，一般为
35~45kb，主要用于真核基因文库的构建。但上述载体的克隆容量有
限，不能满足基因组计划的大片段DNA的克隆，因此，构建了一系列的
人工染色体。YAC的克隆容量为100~2000kb。BAC的克隆容量可达
300kb。利用植物病毒构建了病毒转化载体，但转移的外源基因不能整
合到植物基因组上，以游离拷贝的形式存在。动物基因工程载体主要来
自于动物病毒，用于基因高效表达和基因治疗的研究。相对于植物病毒
转化载体来说，动物病毒载体大多数都能将外源基因整合到宿主基因组
上，随宿主染色体的复制而遗传给后代，主要有SV40病毒载体、反转
录病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体等。第10章 核酸的提取与纯化
基因工程操作能够跨越天然物种屏障，把来自任何生物的基因插入
到新的宿主细胞中并扩增。在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载
体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先并无该类分子的细胞内
并持续稳定增殖和表达。基因工程的所有操作，基本上都依赖于核酸的
操作技术，也就是常说的基因操作的相关实验技术。
核酸在细胞中的含量很少，如核DNA，每个细胞中只有10—15~10
—10g。不同物种细胞核中DNA的平均含量变动很大，但同一物种不同
个体及个体的不同组织，其细胞核中DNA的含量是恒定的。RNA分子
较小，相对分子质量约为2.5×104~2×106。DNA分子很大，相对分子质
量约为106~1011。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有约5%存
在于线粒体、叶绿体等细胞器中，真核生物的RNA则75%左右存在于细
胞质中，约15%存在于细胞器中，约10%存在于细胞核中。原核生物的
DNA集中在核质区。RNA分散在细胞质里，细胞质中的RNA中，以
rRNA的数量最多，tRNA其次，mRNA最少。真核生物的染色体DNA是
双链线状，细胞器DNA、原核生物“染色体”DNA、质粒DNA是双链环
状的。多数生物体的RNA分子是单链线状的。病毒、类病毒所含的
DNA和RNA形式多样。
基因工程的主要操作对象就是核酸，所提取的核酸质量好坏就直接
关系到实验的成败。通常，细胞内的DNA包括基因组DNA和质粒DNA
两大类。基因组DNA的提取一般依据实验材料来选择合适的方法，相对
较为简单；而质粒DNA通常作为载体来进行转化，关系到转化的效率，所以显得尤为重要。
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、限制
性核酸多态性(RFLp)分析以及运用pCR技术分离目的基因等。利用基
因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮
团飘浮其中，可用玻棒将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附
于壁上及底部，从而达到提取DNA的目的。在提取过程中，染色体会发
生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温
和的条件下操作，尽量减少酚氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到
较长的DNA片段，如利用甲酰胺火棉胶袋法，可以得到200kb以上的
DNA片段。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以
上，否则酶切后很少有带合适末端的有效片段。而进行RFLp和pCR分
析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLp片
段(20kb以下)，并保证含有pCR扩增所需要的片段(一般2kb以下)。
不同生物(植物、动物和微生物)基因组DNA的提取方法有所不
同；不同种类或同一种类的不同组织其细胞结构及所含的组分不同，分
离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照相关文献和经
验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多
糖和酚类物质对随后的酶切、pCR等有较强的抑制作用，因此用富含这
类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
质粒DNA的分离方法很多，其依据是利用分子大小不同、碱基组成
的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常
用的有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂(如SDS)裂解法、羟基磷酸灰
石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。碱变性抽提法和煮沸法反应
比较剧烈，均可破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体DNA变性，而
共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕，两条链不会互相分离。当外界条件恢
复正常时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分
子，而较大的线性染色体DNA则难以复性，这两种方法适用于较小的质
粒。去污剂裂解法的条件则比较温和，一般用来分离大质粒(>
15kb)。以上方法均有利弊，有的难以控制，有的得率不高，有的手续
繁琐，还有的纯度不高，因此在制备质粒时，不但要考虑该质粒的特
性，还要考虑提取的质粒DNA的用量与用途，最终选择最佳的实验方
法。
有时所得的DNA纯度不符合进一步操作的需要，还需要进一步纯
化。质粒DNA纯化的方法都是利用质粒DNA相对较小和它的共价闭合
环状特性。常用的纯化方法有CsCl溴化乙锭梯度平衡离心和pEG差别沉
淀。前者可完全分离闭合环状DNA分子，适用于纯化易于产生切口的较
大的质粒(>15kb)。后者省钱省时，但不能有效地将质粒DNA的切口
环状分子与闭合环状分子分开。然而，这两种纯化方法都可得到足以胜
任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA。许多厂家根据离子交换、凝胶
过滤等方法的原理设计了各种商品层析柱，也可快速分离纯化微量的质
粒DNA。基因组DNA可用oligo(dT)纤维素、polyu琼脂糖柱层析、超
离心、分子杂交、电泳等方法纯化。
4.1.1核酸提取与纯化的基本原理
DNA是基因的物质载体，是基因操作的重点对象。在实际操作中主
要涉及两类DNA，其一是目的物种或细胞的基因组DNA，其二是克隆
载体和装载在载体中的克隆化基因。
在进行DNA抽提之前，需进行细胞破碎。细菌细胞有坚硬的细胞
壁，因此必须除去细胞壁才能把细胞内容物释放出来。细胞壁除去的方
法有：①机械法，如超声波、研磨法或匀浆法。
②化学试剂处理，即用EDTA和去离子剂SDS(十二烷基磺酸钠)
处理，EDTA能螯合二价离子，因而使细菌外膜不稳定，从而抑制了
DNase的活性，保护DNA不被降解，而去离子剂则具有溶解膜脂的作
用。
③酶解法，加入溶酶使细胞壁破碎。植物细胞也有细胞壁，但结构
与细菌不同，因此需要采用不同的方法处理，一般采用机械法或酶解法
处理。动物细胞没有细胞壁，因此只用温和的去离子剂溶解细胞膜即
可。
破碎的细胞或组织，去除了细胞壁或细胞质膜所得到的混合物中包
括DNA、RNA与蛋白质、脂肪和碳水化合物。由于细胞突然被裂解，会导致部分染色体断裂，特别是细菌染色体在自然状态下应该是环形
的，此时会有部分开环，变成线形。因此，如果要获得大片段染色体
DNA，温和的裂解条件是很重要的。
破碎细胞后，需采用不同的方法分离DNA、RNA或蛋白质，以获
得高纯度的核酸。
①去除DNA中的RNA。用RNase消化即可去除DNA中的RNA。
RNase是一种热稳定酶，能够除去痕量的DNase，否则DNase会降解
DNA。RNase在使用之前要加热。
②去除RNA中的DNA。去除RNA中的DNA要复杂得多，因为需要
无RNase活性的DNase。不过现在有商品化的无RNase活性的DNase，也
有无DNase活性的RNase。
③去除蛋白质。核蛋白常用蛋白水解酶消化，如蛋白酶K；也可用
高浓度的氯化钠溶液，在高盐溶液中，核蛋白易解聚，游离出DNA。
去除蛋白质是核酸提取至关重要的一步。由于细胞中含有大量降解
核酸的酶，某些蛋白会结合核酸从而干扰核酸提取过程。常见的去除蛋
白质的方法是酚氯仿法(酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1)，酚和氯仿皆
不溶于水。苯酚作为蛋白质的变性剂，可以抑制DNase的降解作用。当
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白质与DNA的联结作用已被蛋白酶K打
断，蛋白质分子表面又含有许多极性基团，与苯酚相似相容，所以蛋白
质分子溶于酚相，而DNA溶于水相。因此，当酚和氯仿加到细胞提取液
中分层，提取液经充分混合后，蛋白质会变性并沉积于中间层。
酚和氯仿都有变性蛋白质的作用，但酚的变性作用要大于氯仿。水
饱和酚的比重略大于水，在高浓度的盐溶液中，会有部分酚跑到水相
中，这不利于DNA的回收。加入氯仿后增加比重，使酚氯仿始终在下
层，方便水相的回收。此外，酚和水有一定程度的互溶性，如果单独用
酚抽提会有大量的酚溶到水相中，抑制后续的pCR操作。可以通过多次酚氯仿抽提来保证除去痕量的酚。酚是剧毒物质，操作时务必戴手套。
而异戊醇的作用仅仅是为了在离心时起消泡的作用，使水相与有机相更
加清晰，以便于水相的回收。
经过酚氯仿处理的匀浆液会分成三层，上层为水相，蛋白质位于中
间层，下层为有机相。经过酚氯仿抽提后，蛋白质被去除。但提取液中
的核酸浓度很低，而且还含有少量酚氯仿(酚可以部分溶解于水)，会
导致以后步骤(如pCR)中酶变性。最好的方法是沉淀核酸，如加入酒
精或异丙醇。当存在一价阳离子(Na+,K+,Nh+4)时，核酸被沉淀的同
时，一些盐也会被沉淀下来，可以用70%的酒精除去沉淀中的盐。
在抽提动物细胞核DNA时存在两个困难(高等植物与此类似)：
①从处死动物、分离组织器官到破碎细胞费时长，在此期间DNA可
能会被DNase降解；动物组织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易
破碎的肝、肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。
②动物细胞核的DNA相对分子质量大，一般比细菌的大2~3个数量
级，比病毒的大4~5个数量。因此对不同生物材料，要根据具体情况选
择适当的分离提取方法。
4.1.2植物细胞核DNA的提取
植物细胞DNA包括细胞核DNA、线粒体DNA与叶绿体DNA。对于
基因组文库的构建，常常需要高质量的细胞核DNA，为了保证文库的插
入片段大、基因组覆盖率高，抽提时常采取一些特殊的处理；而对于普
通用途的细胞核DNA的抽提相对简单。由于细胞壁及植物特有的细胞内
物质，从植物中分离高产量和高质量的DNA并不是一件容易的事，因此
需要用与动物及微生物不同的方法抽提。下面以水稻为例分别介绍这两
种用途的细胞核DNA的提取。
1.基因组文库构建所需细胞核DNA的抽提
取幼苗约30g，用液氮研磨成粉末后置于烧杯中，加入200mL预冷
的抽提缓冲液(10mmolL Tris·hCl ph9.5,10mmolL EDTA
ph8.0,100mmolL KCl,500mmolL蔗糖，4mmolL亚精胺，1mmolL精
胺，0.1%β巯基乙醇)，冰浴下充分匀浆，依次用150、200、400目的尼
龙筛网过滤并不断搅拌。在滤液中加入100mL含20%TritonX100的抽提
缓冲液，冰浴搅拌，按每管50mL分别装入离心管中，4℃1500g离心
10min，收集细胞核，用抽提缓冲液洗涤一遍。用1mL吸管头将核悬浮
并拌匀，45℃水浴中保温2min，加入12体积的1.5%低熔点琼脂糖，拌
匀后注入凝胶片模板并放于4℃冰箱促进凝固，制备好的琼脂糖凝胶块
用5倍体积裂解液(0.45molL EDTA,1%Sarkosyl,0.25mgmL蛋白酶K)
50℃轻轻摇动洗涤，50℃保温1～2天，用TE洗凝胶片3次，每次
20min。再用含1mmolL pMSF(phenylmethyl sulfonl fluoride，溶于异丙醇中)的TE在50℃保温1h。通过上述处理后，琼脂糖凝胶块中包含制
备好的超大片段基因组DNA。
高相对分子质量基因组DNA的制备是构建基因组文库的一大难关，关键是控制好细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量，包括细胞核的质量
和浓度、琼脂糖凝胶的浓度等。若细胞核在包埋之前破裂、细胞核浓度
太低、琼脂糖浓度过高等，都会造成失败。为了防止细胞核的破裂，用
于建库的组织始终在液氮中研磨且不能研磨得过细，做细胞核悬浮时动
作必须轻柔。包埋的琼脂糖浓度过高会影响酶切效果，甚至造成无法酶
切。研磨时液氮充分，大片段的操作除酶切外全部在4℃以下进行，这
样就有效防止了DNA的物理损伤和降解。选用绿色嫩叶为原材料，对粗
提的细胞核进行洗涤时，可以减少叶绿体的污染情况，纯净的细胞核是
浅黄色的，若颜色偏绿，可通过增加洗涤次数和降低离心速度来减少叶
绿体的污染。若在进行脉冲电泳分离后切下的片段太大，则连接效率就
太低，故切下大小为100～300kb的片段，连接效率高，产生的白色菌落
多，蓝色菌落很少。
2.非构建文库所使用的细胞核DNA的抽提
常采用CTAB法和SDS法来抽提植物基因物总DNA，抽提出来的
DNA基本上是细胞核DNA。CTAB法提出的DNA纯度较高，且能除去多
糖类物质，但如果所需要的DNA量不多，要求也不高，可使用SDS法微
量抽提。SDS法提取DNA时，只需要取新鲜叶片1g左右，用液氮研磨成
粉末，倒入2mL的离心管，加入800μL1.5%SDS微量抽提液，65℃水浴
30min，加入等体积的氯仿异戊醇乙醇(76∶4∶20)，混匀后，12000rmin离心8min，上清液转移到1.5mL离心管，加入等体积异丙醇
或2倍体积无水乙醇沉淀，12000rmin离心3min，弃上清，用0.5mL70%
的乙醇漂洗，风干，溶于50～100μL TE备用。
对于植物细胞核DNA的抽提，应根据实验目的选用不同的抽提方
法。另外，不同的植物材料，抽提的方法也略有不同，如果是植物材料
本身含糖量比较高，通常采用以下方法处理：
①在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：
100mmolL Tris·hCl(ph=8.0)、5mmolL EDTA和0.35molL Sorbitol洗
几次。
②使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35倍体积的无
水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。
③沉淀DNA时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀
溶液中加入12体积的5molL NaCl，或加Nh4Ac，使终浓度为
10mmolL；或0.5mL DNA液中加0.125mL4molL NaCl和
0.625mL13%pEG8000(冰浴1h)。④多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。如用TE缓冲液反复清洗共
沉淀物，将清洗液合并再用乙醇沉淀DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂
糖电泳，切下DNA部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还
有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(12体积)，氯苯可以与多糖的羟
基作用而去除多糖。
上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一
定程度上降低DNA的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱
层析方法，使用对DNA具有特异性吸附的树脂来纯化DNA。
4.1.3核外DNA的提取
作为遗传物质的DNA，除细胞核DNA外，在植物中还有线粒体
DNA和叶绿体DNA，在动物中有线粒体DNA，细菌中有质粒DNA。其
中质粒DNA的应用最为广泛，基因的克隆与鉴定、载体骨架的构建等都
离不开质粒DNA。因此，我们首先介绍质粒DNA的抽提。
以大肠杆菌为例，在大肠杆菌中的质粒有大有小，拷贝数有高有
低，因此分离的方法也多种多样。在实践中最常见的操作是通过碱裂解
法提取高拷贝的小质粒。
一般从对数生长期的大肠杆菌细胞中提取质粒。由于绝大多数基因
操作的质粒载体都带有抗生素抗性基因，为了保证在生长过程中质粒不
会丢失，所以在生长培养基中要加入适量的抗生素。最常见的抗生素是
氨苄青霉素，其次是四环素、氯霉素和卡那霉素。
1.碱裂解法提取E.coli质粒DNA的原理
碱裂解法提取质粒DNA是经典的方法，由Birnboim和Doly设计并于
1979年发表。该方法不仅用于大肠杆菌质粒DNA的提取，其工作原理也
广泛应用于其他微生物质粒的提取。
裂解法提取质粒的整个过程主要用到3种溶液，即溶液Ⅰ、Ⅱ和
Ⅲ。其核心原理是，在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持
环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而
将质粒DNA与染色体DNA分开。对于高拷贝的质粒，如pUC和pGEM系
列质粒，一般每毫升培养液可得到3～5μg DNA，可以满足大多数常规
DNA的操作。
在微量抽提过程中，一般取1～2mL菌体培养物，用缓冲液洗去残
液和菌体碎片或分泌物。要提取质粒必须首先破碎细胞让质粒从细胞中
游离出来。为此，第一步先用溶液Ⅰ将细胞悬浮起来。该溶液含有
50mmolL葡萄糖和10mmolL EDTA，其中葡萄糖用于在溶菌酶作用时
维持渗透压；而EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，用于
抑制DNase的活性和抑制微生物的生长。由于E.coli容易破裂，现在不再
加溶菌酶了。但尽管如此，人们仍然习惯使用溶液Ⅰ的初始配方。第二步加入2倍于溶液Ⅰ体积的溶液Ⅱ，该溶液含有0.2molL NaOh和
1%SDS。在这种情况下，细胞会很快破裂，使混浊的细胞悬浮液变成完
全澄清的黏稠液体，此时，在ph12.0～12.5这样狭小的范围内染色体
DNA和蛋白质变性，质粒DNA释放到上清中。细菌蛋白质、破裂的细
胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕形成大型复合物，后者被SDS包
被。虽然碱性溶剂使碱基配对完全破坏，但闭环的质粒DNA双链不会彼
此分离，因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。最后，加入1.5倍于溶液
Ⅰ体积的溶液Ⅲ，该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液(3molL，ph4.6)。
在中和过程中，钾离子取代SDS中的钠离子，复合物从溶液中沉淀下
来。质粒DNA在变性之后经过中和仍保持环状，处于可溶解状态。经高
速离心，上清液即为质粒DNA粗制品。在该粗制品中含有大量的盐，以
及小分子RNA和部分蛋白质，一般不能直接使用。用两倍体积的乙醇进
行DNA沉淀，便可获得质粒DNA样品。此时，该样品可满足一般的操
作要求，如酶切等。在乙醇沉淀之前，可用RNase A去除RNA，用苯酚
氯仿抽提去除蛋白。如果要得到更高纯度的样品，可做进一步纯化处
理，如密度梯度离心等。
2.碱裂解抽提质粒DNA过程中应注意的问题
(1)碱抽提法成功的标志是把染色体DNA、蛋白质和RNA去除干
净，获得一定质量的质粒DNA。去掉染色体最为重要，也较困难，因为
在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入
NaOhSDS溶液与3molL NaAc(ph4.8)溶液，控制好变性与复性操作
时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体
DNA不断裂成小片断，且能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌
液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶菌液加入时可用力振荡几
次，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体DNA尚未释放，不
必担心其分子断裂，但当加入SDS以后，则要注意不能过分振荡，但又
必须让它反应充分，这是一对矛盾，要处理适当。
(2)当加入NaOhSDS溶液5min后，没有看到溶液变黏稠时，不
能进行下一步实验。要检查所用的试剂是否正确，质量是否符合实验要
求(对SDS的质量要求较高，有报道曾用未经重结晶的分析纯的SDS，实验没有成功，后来改用进口的Sigma产品，质粒DNA的收得率很
高)，待找到原因补救后才可继续做下去，不然，提取到最后，将提不
到质粒DNA或收得率极低。
(3)在提取时使用的试剂，除了要用重蒸水配外，所用器皿必须
严格清洗，最后要用重蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都
要进行高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酚对DNA的降解。对Eppendorf
管子、Tip或非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃高温干燥箱中烘干使用。
(4)加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖颠倒摇动4～5次，注
意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放入冰箱中去沉淀
DNA。
(5)乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管内壁的上清液抽干或自然
挥发，不然，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不安全。在用真空泵
抽真空时，气流太强易使DNA飞溅而损失，所以在装有DNA的管口常
用parafilm包装于管口或覆盖一层薄纸，在纸上打若干个小洞。另外，抽真空时间也不要太长，防止DNA成粉末状而遭损失。
(6)最后一次沉淀DNA用的离心管应是干净、灭过菌、最好是经
过硅化的管子(极少量的TE缓冲液不会因吸附在壁上不能完全收集而
损失质粒DNA)。
碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA
可用于酶切、连接与转化。该方法操作不慎，会影响纯度，且步骤复
杂，费时较多。对于相对分子质量较大、拷贝数较少的质粒DNA，由于
DNA片段大易于损伤断裂，因此可选用氯化铯密度梯度离心法抽提
DNA。该方法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超
螺旋构型等特点。
3.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA
现在有些公司开发出了纯化质粒DNA的试剂盒，著名的有Qiagen公
司的产品，如QIAprep Spin Miniprep Kit。其核心技术是使用一种特制的
微型离心纯化柱(QIAprep spin column)，在柱中有一种特殊的硅胶膜
(silica membrane)。在高浓度盐条件下该膜可以结合多至20μg的
DNA，最后用小体积的水或低离子强度的缓冲液可将DNA洗脱出来。
分离纯化过程是通过一个简单的结合—洗涤—洗脱程序来完成的。
首先用碱裂解法获得质粒DNA粗制品，之后将样品通过纯化柱的硅胶
膜，使之吸附质粒DNA。然后用50%乙醇洗涤滤膜，洗去杂质，最后用
少量洗脱缓冲液或水洗脱出纯DNA。纯化的质粒DNA适合大多数酶学
反应，包括限制性酶切和DNA测序等。除了从大肠杆菌纯化质粒外，从
酿酒酵母、枯草牙胞杆菌和根瘤农杆菌中纯化质粒DNA亦可用试剂盒。
这种方法操作简便、回收率高，洗脱出来的DNA可立即使用，无需
沉淀、浓缩或脱盐。因此该产品越来越受到研究工作者的青睐，但同时
也有忘却质粒DNA分离纯化原理的倾向。
除了上述方法外，还有其他方法用于大肠杆菌质粒的提取，对相对
分子质量大且拷贝数很低的质粒有专门的分离方法。
除质粒DNA，核外DNA在植物中还有线粒体DNA和叶绿体DNA，动物中也有线粒体DNA。植物线粒体DNA与核DNA相比，在细胞内含量甚微，提取过程中极易被细胞核及叶绿体DNA污染，因此有一些特殊
的抽提方法；同样，叶绿体DNA以及动物线粒体DNA也有各自特殊的
抽提方法。
国外提取纯化水稻线粒体DNA的方法有：Douce方法、pring方法和
Levings方法，国内有蔗糖不连续梯度方法等。国外提取线粒体的方法
需要的试剂价格昂贵、购买困难等，而国内所用的蔗糖不连续梯度方法
步骤繁琐，特别在吸取中间层黄色液时比较困难，费时又耗材。
高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNaseⅠ法、蔗糖密度梯度
离心法、percoll梯度法、无水法和高盐低ph法等。
动物线粒体DNA的提取方法，主要有：
①氯化铯密度梯度离心法，此法不但设备昂贵，而且实验时间较
长，目前已经很少使用；
②柱层析法，此法所需设备也较昂贵，而且实验时间也较长；
③DNase法，此法在差速离心获得线粒体后，通过DNase消化，有
效地去除线粒体表面附着的核DNA，是目前常用的方法；
④碱裂解法，此法是借鉴质粒快速提取法而建立的，在差速离心获
得线粒体后，通过碱裂解变性，高盐溶液复性，分离环状的线粒体DNA
和线性的核DNA，从而获得线粒体DNA，此法也是目前常用的方法；
⑤改进高盐沉淀法，利用SDS(十二烷基磺酸钠)破坏细胞膜、核
膜，使蛋白质变性，从而游离出核酸。EDTA能抑制细胞中DNA酶的活
性。蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽。加入饱和乙酸钠后，绝大部
分线性大相对分子质量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀，而环
状线粒体DNA仍为自然状态，通过高速离心，除去绝大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质，线粒体DNA仍留在上清中，此法在碱裂解法的
基础上做了一些改进，它们的原理是一样的，都是效仿质粒的提取方
法。
4.1.4RNA的提取
cDNA文库的构建、蛋白质体外翻译、Northern斑点分析等需要一
定纯度和一定完整性的RNA。能否获得完整的RNA，取决于能否最低
限度地避免提取和纯化过程中内源及外源RNase对RNA的降解。由于
mRNA分子结构的特点，容易受RNase的攻击而降解，加上RNase极为
稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNase的污染，并设法
抑制其活性。所有的组织中均存在RNase，人的皮肤、手指、试剂、容
器等均可能被污染，因此全部操作过程均需戴手套并经常更换。
RNA酶抑制剂主要有：
①RNA酶的蛋白质抑制剂。目前从人胎盘分离的一种蛋白质可与多
种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，可使RNA酶失活。此蛋白质在体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸
序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子。由于酚抽
提可以去除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。
②氧钒核糖核苷复合物。这种由氧钒(Ⅳ)离子和4种核糖核苷之
中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNA
酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复
合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度
都是10mmolL。所得到的mRNA可直接在蛙卵母细胞中进行翻译，并
能作为某些体外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核
苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟
基喹啉的苯酚多次抽提以去除之。
细胞内总RNA的抽提方法很多，在实难室中常采用的方法有两种，一种是酚异硫氰酸胍抽提法和硅胶膜纯化法。
1.酚异硫氰酸胍抽提法
TRIZOL试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂，由Gibco公司
根据酚异硫氰酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，适用于
绝大多数生物材料。对任何生物材料的RNA的提取，首先研磨组织或细
胞，或使之裂解；加入TRIZOL试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成
分，还可保持RNA的完整；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；
收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。该RNA样品
几乎不含蛋白质和DNA，可直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA
纯化、体外翻译、RNase保护分析(RNase protection assay)和分子克
隆。
2.硅胶膜纯化法
RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与DNA的分离纯化
思路相似，也就是含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA吸
附在硅胶膜上，从而与其他细胞成分分开，然后在低盐浓度下RNA可从
硅胶膜上洗脱出来。其技术将异硫氰酸胍裂解的严格性和硅胶膜纯化的
速度和纯度相结合，简化了总RNA的分离程序。相当于将异硫氰酸胍裂
解法制备的RNA的水相，通过硅胶膜来纯化。用该试剂盒分离纯化的
RNA纯度高，含有极少量的共纯化DNA。
上述两种方法纯化的RNA如果要用于对少量DNA也敏感的某些操
作，如pCR操作，可使用无RNA酶的DNaseⅠ(RNaseFree DNase Ⅰ)
处理去除痕量的DNA。如果需要特别纯净的样品，可以通过CsCl密度梯
度离心来纯化。
分离的总RNA可利用mRNA3′末端含有poly(A)+的特点，当总
RNA流经oligo(dT)纤维柱时，在高浓度盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐
溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得
到较纯的mRNA。
核酸提取注意事项如下：
(1)在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体
破碎度，以释放更多的游离核酸，常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保
没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。
(2)有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可
在蛋白酶缓冲液中用终浓度为5mmolL的EDTA代替NaCl，并且可将反
应温度提高到50～60℃，并将反应时间缩短到15～25min，但酶用量必
须提高10～20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子
对酶有抑制。
(3)许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用
下，被氧化成有色的醌类物质，影响核酸的提取及降低提取质量，在提
取液中加入pVp和巯基乙醇对降低酚类的干扰可能有所帮助。pVp将与
酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离，且pVp与巯基
乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一
定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
(4)许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具
体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳
观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法：CTAB多次
抽提；在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右)，对低浓度
样品再进行沉淀；在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5molL NaCl作为沉
淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到15～12的体积，异丙醇可用到0.6～
1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐的存在将使大量多糖存在溶液
中，从而达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操
作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
(5)在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力
强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此用酚抽提后，除可能损失部分
核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑
制，因此在操作中既可单用氯仿作变性剂，也可用酚氯仿混合液作变
性剂，也可单用酚作变性剂，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用
氯仿抽提。
(6)在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙
醇，所以一般用2倍体积的乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异
丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多
糖、杂蛋白污染更为有效。在提取核酸时如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，-70℃下大于30min;-20℃过夜将有助于增加核酸的沉
淀量。
(7)在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水，因此时离
子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液
中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外，核酸
样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降
解。
核酸提取后可通过pCR、RTpCR直接扩增出目的基因片断，也可首
先构建文库，然后由RACE、DDpCR等差异显示技术、AFLp等标记技
术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文
库中筛选出完整基因。
4.1.5核酸的纯化
1.超离心
许多细胞器和生物大分子在普通离心力场中不易沉淀，必须在高速
或超速(一般以每分钟2万转以上为超速)离心力场中才会沉降。超离
心按原理可分为两类：沉降速度超离心和沉降平衡超离心。这两种超离
心可用于分析实验，测定核酸的相对分子质量、沉降系数(S)或浮密
度(ρ)，也可用于制备实验以纯化核酸制品。
(1)沉降速度超离心根据被分离物质在强大的离心力场中沉降速
度的不同进行分离。核酸的沉降速度与核酸的相对分子质量、形状、离
心力场的强度及介质的黏度有关。离心力场强度越大、介质黏度越小，则沉降速度越快；核酸相对分子质量越小、形状越伸展，则沉降速度越
慢，沉降系数相应也越小。
沉降速度法中常用5%~20%(WV)蔗糖，用梯度仪或手工预先在
离心管中铺设好连续梯度或阶段梯度，再将核酸样品铺于梯度之上，离
心后分部收集，用电泳法或紫外吸收法检测各分部，即可知核酸所在部
分。
(2)沉降平衡超离心根据被分离物质浮密度ρ(溶剂化密度)的不
同进行分离。核酸的浮密度与核酸的碱基组成、高级结构及溶液介质有
关。含GC越多、结构越紧密的DNA浮密度越高，不同介质与核酸结合
情况不同，会使其浮密度发现变化。
2.凝胶电泳
凝胶电泳是目前应用很普遍的分离纯化核酸的方法，操作简便，设
备易置，而且快速灵敏，在琼脂糖凝胶电泳时，荧光染料EB(溴乙
啶)能插入DNA或RNA的碱基对平面之间而形成荧光络合物，在紫外
光的激发下产生橘黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与
DNA分子长度和数量成正比，所以荧光强度可以表示DNA量的多少。用荧光染料溴乙啶(EB)染色，可检测到少至1ng的DNA。如将已知浓
度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若
用薄层分析扫描仪检测，只需要5～10ng DNA，就可以从照片上比较鉴
别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1mg的DNA。
除了分离纯化核酸外，胶电泳还常用于鉴定核酸制品的纯度和测定
核酸的含量及相对分子质量。胶电泳的材料一般有两种凝胶，一种是聚
丙烯酰胺(polyacrylamide gel,pAG)，孔径小，适合分离1000个核苷酸
以下的核酸分子。另一种是琼脂糖凝胶(agarose)，孔径大，适合分离
较大的核酸分子。
3.柱层析
与其他纯化方法相比，柱层析的优点是容量大，分离量可达毫克级
甚至克级水平。柱层析按原理分有如下几种：凝胶层析、离子交换层
析、亲和层析，此外还有体外重组DNA法、Rloop法和免疫法等。第11章 核酸的检测与保存
4.2.1核酸的检测
由于所用材料的不同，得到的核酸产量及质量均不同。分离纯化的
DNA是否真的存在、是否有降解现象以及DNA经限制性内切酶酶切后
其产物的大小如何等在基因操作中所面临的问题，均需检测所获得核酸
的产量和质量。
目前采用的方法很多，如直接用紫外光谱分析法、EB荧光分析法
和琼脂糖电泳检测。其中最成熟的检测DNA的技术是琼脂糖电泳检测。
1.紫外光谱分析法
由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共轭双键，使核酸分子在紫
外260nm波长处有最大吸收峰，这个性质可用于核酸的定性和定量测
定，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。这要与蛋白
质在280mm波长处有最大的吸收峰相区别，又因为分子生物学实验核酸
提取过程中，蛋白质是最常见的杂质，故常用OD260OD280来检测提取
的核酸纯度如何。
核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少
30%~40%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成
的。
天然双链DNA在260nm处的吸收值与在280nm处的吸收值的比值
(A260A280)为1.8左右。RNA在260nm和280nm处的吸收值之比约为
2.0。根据核酸溶液在260nm波长处的紫外吸收值，可按下式大致估算核
酸的浓度：1A260=50μgmL(双链DNA)，1A260=40μgmL(单链
DNA、RNA)，1A260=20μgmL(寡核苷酸)。
衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值。当
OD260OD280值>1.8时，说明含RNA等杂质；当OD260OD280值1.8
时，说明含蛋白质和苯酚等。当OD260OD2800.9时，该样品可适当稀
释，用TE饱和的酚、氯仿异戊醇各抽提一次，再用无水乙醇沉淀、抽
干，TE悬浮，再用紫外分光光度计测定。由于测定OD260时，难以排除
RNA、染色体DNA以及DNA解链的增色效应的影响，因此测得的数据
往往比实际浓度偏高。用紫外分光光度法可以通过OD260和OD280测出
DNA的浓度和纯度，但不能区分DNA的超螺旋、开环、线状三种构
型，也不能区分染色体DNA。
2.琼脂糖电泳检测
琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物，在高温水溶液下会溶
解，在常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质。在 ......
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