第08章 细胞凋亡于肿瘤 .doc
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第八章 细胞凋亡于肿瘤
第一节细胞凋亡的基本特点及其检测方法
一、细胞凋亡和细胞坏死的区别
特点细胞凋亡细胞坏死形态学方面：细胞体积萎缩.与周围细胞分离细胞肿胀细胞膜膜发泡，通透性下常，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(PS)完整性破坏，通透性增加细胞核先固缩，后降解溶解溶酶体完整裂解线粒体浓缩，跨膜电位受损，细胞色素c释放肿胀，破坏，能量生成受损生物化学方面DNA非随机性DNA裂解，ladder，核小体间剪切非特征性剪切蛋白质Caspases活化非特征性降解底物特异性降解非特异性水懈抗死亡分子Bcl 2家族，Caspases 抑制剂有时受Bcl-2调控对ATP的要求必需无需组织分布单个细胞细胞群体结局(组织反应被吞噬细胞吞噬，不引起炎症反血释放细胞碎片，引起炎症反应二、评价凋亡的基本方法
(一)细胞膜完整性和细胞形态学的评价
多数体外培养体系中，凋亡细胞并不能被机体清除。最终它们将和坏死细胞一样，发生细胞膜的损伤和肿张、裂解。因此，应用培养细胞研究细胞凋亡的发生机制时.严格区分这种继发性坏死(secondary necrosis)和真正意义上的细胞坏死是非常重要的。
1.细胞膜完整性的评判：台盼蓝去染法和丫啶橙/溴化丙啶双染法。丫啶橙(AO)和溴化丙啶EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色和橙色荧光。其中AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞。
2.应用光学显敝镜的形态学检测：它仍然是区分细胞凋亡和坏死的最基本和最重要的手段。
3应用电子显微镜的形态学检测 ：超微结构观察可显示凋亡细胞的许多特点。
(二)DNA断裂的检测方法
* 在细胞凋亡中非随机性DNA裂解产生的寡核小体片段在琼脂糖凝胶电泳图谱上表现为特征性的DNA梯子(DNA ladder)
* 3H-TdR预先标记细胞内DNA后，离心分离降解(低分子量DNA)和完整(高分子量DNA)组分，并分别测定两个组分的DNA含量。根据降解DNA组分占整个细胞DNA的百分率间接地对凋亡细胞进行定量测定。
* 原位末端标记(in Situ end-labeling)技术也是定量凋亡细胞的有效方法
(三)流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
* 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是分析细胞学研究的重要工具。
* 凋亡细胞在固定和清洗时，降解的小分子量DNA外漏，导致细胞内DNA含量减少。凋亡细胞常常以亚二倍体形式出现。该亚二倍体细胞群被称为亚Gl期(sub-G1)细胞。它的出现被认为是细胞凋亡的重要标志。
(四)Annexin V的检测
* 磷脂酰丝氨酸外翻是早期凋亡细胞的重要特征之一。
* 依赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V能够和PS高亲和结合。敏感探针，用于凋亡细胞的检测
(五)原位末端标记技术
* ISEL技术是根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的缺失部分的基本原理，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。
* 最常用的是荧光素FITC标记三磷酸核苷酸。因此，可以通过FCM或荧光显微镜检测相应的荧光强度，达到了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞的数量。
* 根据采用的DNA聚合酶不同，ISEL至少包括三种方法：①DNA缺口平移法：②原位末端标记法：③末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)：
三、细胞凋亡的生物学意义概述
* 在多细胞生物体，特定组织器官的细胞类型和细胞数量是相对恒定的。这种恒定主要取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡。
* 和细胞增殖一样，细胞凋亡对于多细胞生物体的发育和稳态的维持是至关熏要的，* 细胞凋亡明显影响胚胎和婴儿发育的所有方面。
* 细胞DNA损伤可诱导抑癌基因p53的表达。它使细胞停滞于G1期，以便提供足够的时间对损伤的DNA进行修复(参见第四章)。在细胞损伤严重以致修复无能的情况下，p53则触发细胞凋亡。
* 细胞凋亡和衰老密切相关。1. 清除损伤或无功能的细胞，并以新细胞替代之，从而保持组织自稳态；2. 清除不可替代的分裂后细胞如神经元、心肌细胞，使机体免患疾病。
第二节细胞凋亡的发生机制
* 细胞凋亡的发生发展过程可划分为三个时期，即诱导期、效应期和降解期。
* 最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。
* 它们诱导和调控细胞凋亡的基本机制是：
* Ced-3是具严格底物特异性的"半胱氨酸蛋白酶"。它通常以酶原(前体)的形式存在于细胞内。
* 细胞凋亡时，活化的Ced-3特异地降解蛋白底物，诱导凋亡细胞的特征性形态学和生物化学变化。
* Ced-4既能结合Ced-3，也能与Ced-9结合。
* 在非凋亡细胞，Ced-9以Ced-4为中介和Ced-3结合成三体复合物，扣押Ced-3使其以无活性的酶原形式存在于细胞内。
* 在凋亡诱导信号的作用下，Ced-9自复合物中解离。这可能与新近发现的EGL-1有关。
* EGL-1能够结合Ced-9.并替代三体复合物中的Ced-4/Ced-3，导致Ced-3在Ced-4的用下活化，并促使细胞凋亡。
* Ced-3和Ced-9在人体的类似物分别代表两大家族，即Caspases家族和Bcl-2家族
* 与Ced-4同源的只有凋亡活化因子(Apaf-l)。
* 哺乳动物细胞凋亡机制的认识?已经发展为两种概念。
* 其一，Caspase在细胞凋亡过程中发挥重要作用。
* 其二，过去从凋亡细胞主要表现为细胞核的改变出发，提出细胞凋亡发生的始动环节存在于细胞核。新近研究显示细胞核的改变是细胞凋亡的结果，而不是其原因。
一、Caspases和细胞凋亡
Caspases 1993年，袁钧英等发现Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1?转化酶(interlukin -? converting enzyme, ICE)存在功能和序列相似性。和Ced3一样，ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。随后发现14个ICE/Ced-3家族成原。为了避免命名上的混乱，袁钧英等在1996年10月组成了一个专门小组，推荐将ICE/ced-3家族成员统一命名为Caspase (Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases)，而对其家族成员，则按发现先后为序，在Caspases后以阿拉伯数字表示。
(一)Caspases的结构和活性特点
* Caspases家族有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。它们都以酶原形式表达。
* Caspase酶原由?原结构域(prodomain)、大亚基和小亚基构成。
* Caspase属于?半胱氨酸蛋白酶。严格的底物特异性，即异常特异地剪切天冬氨酸残基后的肽键(Asp-X)。
* Caspase的活性也显示高度有效性。
(二) Caspase的活化机制和死亡受体(p153)
* Caspase前体在活细胞中大量存在、表达，在凋亡时才被快速活化
* 凋亡中的Caspase可分为?始动或上游(如Caspase-2，8-10等)和效应或下游Caspase (如Caspase-3，6和7)两大类。
* 在凋亡诱导信号的作用下，始动Caspase通过结合特异辅因子而活化。活化的始动Caspase进一步活化效应Caspase。正是效应Caspase参与凋亡降解期中发生的重要底物的剪切。
* 死亡受体(death receptor，DR)是指能够通过与其相应的死亡配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞表面蛋白。它们主要包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族。
* 该家族成员除了具有相似的、富集半胱氨酸的细胞外结构域外，其胞浆区内包含死亡结构域(death domain，DD)。
* 在Fas/Fas配体(FasL)信号途径中，Fas相关的死亡结构域蛋白(Fas associated death domain)，FADD)具重要作用。
* FADD分子除了包含DD结构外，也含死亡效应结构域(Death effector domain，DED)。
* FasL分子以三聚体形式和三个Fas分子交联，导致Fas的DD成簇。后者以其DD为中介结合FADD，形成死亡诱导信号复合体(death inducing signal complex，DISC)。随后，FADD通过其DED结构域和Caspase8的DED区相互作用，导致Caspase 8形成寡聚体，并驱使其自身活化。活化的Caspase 8进一步活化效应Caspase，如Caspase-3等，使细胞发生凋亡。
* TNF具有多重生物学效应。它通过结合TNF-R1，活化转录因子NFkB和AP-l，诱导促炎症和免疫调节基因的表达。
* TNF也通过TNF-R1诱导细胞凋亡。
* TNF和TNF-R1的结合导致TNF-Rl形成同三聚体。随后，TNF-R1的DD乃与TNFR相关的死亡结构域蛋白(TRADD)分子的DD交联。
* TRADD分子的DD作为辅助因子分别结合TRAF2(TNF receptor-associated factor)和RIP(receptor interacting protein)结合，导致NF-kB和AP-1的活化，而与FADD的结合则通过和Fas/FasL相同的途径诱导细胞凋亡。
Caspases的作用底物
根据其生物学功能，Caspase划分为两个亚家族：它们分别以Ced-3和ICE为代丧。其中，ICE亚家族(Caspase-1，4，5)主要辅助促炎症反应，而Ced-3亚家族(Caspases2，3，6，7，8，9，)则主要参与细胞凋亡过程。3、6、7还是效应分子。
提示Caspase可能通过如下几种机制参与凋亡过程：
* 灭活细胞凋亡抑制蛋白：Caspases对ICAD的剪切。Caspases活化的DNA酶(caspase activated deoxyribonudease，CAD)可能是导致凋亡细胞发生非随机性DNA降解的特定核酸酶。在非凋亡细胞，CAD和其抑制物(Inhibitor of CAD，ICAD)结合形成无活性复合物。细胞凋亡时，Caspase剪切ICAD，并致其失活。于是，CAD游离并进入细胞核内降解DNA。
* 剪切细胞结构蛋白：核板(nuclear lamina)的解体。细胞凋亡过程中，Caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷和染色质浓缩。
* 剪切细胞效应蛋白：Caspase可能作用于DNA修复、mRNA拼接和DNA复制相关蛋白，使其活性丧失或失调。
总之，Caspase是细胞凋亡调控的关键分子群。它们通过切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、关闭DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等，在细胞凋亡过程中起着重要作用。
二、线粒体和细胞凋亡
* 细胞游离系统(cell-frees system)：于完整细胞中将细胞核和细胞浆分离，制备无核细胞(cytoplast)和裸核细胞。它可以独立分析细胞浆和细胞核在细胞凋亡中的作用。
* 细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱，并认为是导致细胞不可逆性死亡的关键环节。
(一)细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的变化
* 线粒体是由双层膜包裹的囊状结构。外膜通透性较大，内膜通透性小，内膜存在一些载体蛋白和通道如质子泵。能有效地将线粒体基质内的质子泵入外室，从而形成横跨线粒体内膜、表现为内负外正的线粒体跨膜电位(mitochondrial transnlembrane potential，??m)。
* 几乎所有凋亡时都伴随??m下降。
* ??m下降多发生在凋亡的形态学和生物化学改变之前
* 线粒体跨膜电位的维持依赖"线粒体膜通透性转运孔"(mitochondrial permeabilityTransition pore，MPT)，定位于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体。
* 在生理情况下，MPT呈周期性开放，使外室里的质子进入基质，从而防止质子在外室过度蓄积。然而，MPT的持续开放和关闭则分别诱导和抑制细胞凋亡。
* MPT抑制剂cyclosporine，对细胞凋亡也具抑制效应。相反，苍术苷和Bax则诱导MPT开放和细胞凋亡。
* 几乎所有诱导细胞凋亡的因素都可以造成MPT的破坏，* 这些因素又可进一步导致MPT的开放和??m的破坏。因此，MPT具有自我放大效应和很可能是一种"全或无"的开关。
(二)MPT开放导致线粒体释放Caspase活化物
* 在许多细胞凋亡模型中，MPT的开放伴随线粒体外膜的物理性损伤。
* 外膜的物理性损伤导致定位于线粒体外室的Caspase活化物的释放。
* 在死亡早期，细胞凋亡和细胞坏死具有相同的信号途径，即MPT破坏。
* 细胞色素C的释放究竟触发细胞凋亡还是细胞坏死主要取决于细胞类型。
* 在有足量细胞色素C可利用的细胞，氧消耗和ATP生成保持正常水于，MPT的破坏诱导Caspase活化和细胞凋亡。
* 在含大量内源性Caspase抑制剂的细胞，细胞色素C的释放并不能诱导Caspase依赖的细胞凋亡，相反导致电转运能力的破坏和氧消耗和ATP生成减少，进而触发细胞坏死。
* 在ATP存在时细胞走向凋亡。反之，则发生坏死。
* 除了细胞色素C外，线粒体也释放凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)
* AIF无核酸内切酶活性，但它可以直接活化下游Caspase，甚至直接裂解某些选择性底物，迅速诱导核凋亡。......（后略) ......
第八章 细胞凋亡于肿瘤
第一节细胞凋亡的基本特点及其检测方法
一、细胞凋亡和细胞坏死的区别
特点细胞凋亡细胞坏死形态学方面：细胞体积萎缩.与周围细胞分离细胞肿胀细胞膜膜发泡，通透性下常，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(PS)完整性破坏，通透性增加细胞核先固缩，后降解溶解溶酶体完整裂解线粒体浓缩，跨膜电位受损，细胞色素c释放肿胀，破坏，能量生成受损生物化学方面DNA非随机性DNA裂解，ladder，核小体间剪切非特征性剪切蛋白质Caspases活化非特征性降解底物特异性降解非特异性水懈抗死亡分子Bcl 2家族，Caspases 抑制剂有时受Bcl-2调控对ATP的要求必需无需组织分布单个细胞细胞群体结局(组织反应被吞噬细胞吞噬，不引起炎症反血释放细胞碎片，引起炎症反应二、评价凋亡的基本方法
(一)细胞膜完整性和细胞形态学的评价
多数体外培养体系中，凋亡细胞并不能被机体清除。最终它们将和坏死细胞一样，发生细胞膜的损伤和肿张、裂解。因此，应用培养细胞研究细胞凋亡的发生机制时.严格区分这种继发性坏死(secondary necrosis)和真正意义上的细胞坏死是非常重要的。
1.细胞膜完整性的评判：台盼蓝去染法和丫啶橙/溴化丙啶双染法。丫啶橙(AO)和溴化丙啶EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色和橙色荧光。其中AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞。
2.应用光学显敝镜的形态学检测：它仍然是区分细胞凋亡和坏死的最基本和最重要的手段。
3应用电子显微镜的形态学检测 ：超微结构观察可显示凋亡细胞的许多特点。
(二)DNA断裂的检测方法
* 在细胞凋亡中非随机性DNA裂解产生的寡核小体片段在琼脂糖凝胶电泳图谱上表现为特征性的DNA梯子(DNA ladder)
* 3H-TdR预先标记细胞内DNA后，离心分离降解(低分子量DNA)和完整(高分子量DNA)组分，并分别测定两个组分的DNA含量。根据降解DNA组分占整个细胞DNA的百分率间接地对凋亡细胞进行定量测定。
* 原位末端标记(in Situ end-labeling)技术也是定量凋亡细胞的有效方法
(三)流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
* 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是分析细胞学研究的重要工具。
* 凋亡细胞在固定和清洗时，降解的小分子量DNA外漏，导致细胞内DNA含量减少。凋亡细胞常常以亚二倍体形式出现。该亚二倍体细胞群被称为亚Gl期(sub-G1)细胞。它的出现被认为是细胞凋亡的重要标志。
(四)Annexin V的检测
* 磷脂酰丝氨酸外翻是早期凋亡细胞的重要特征之一。
* 依赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V能够和PS高亲和结合。敏感探针，用于凋亡细胞的检测
(五)原位末端标记技术
* ISEL技术是根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的缺失部分的基本原理，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。
* 最常用的是荧光素FITC标记三磷酸核苷酸。因此，可以通过FCM或荧光显微镜检测相应的荧光强度，达到了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞的数量。
* 根据采用的DNA聚合酶不同，ISEL至少包括三种方法：①DNA缺口平移法：②原位末端标记法：③末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)：
三、细胞凋亡的生物学意义概述
* 在多细胞生物体，特定组织器官的细胞类型和细胞数量是相对恒定的。这种恒定主要取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡。
* 和细胞增殖一样，细胞凋亡对于多细胞生物体的发育和稳态的维持是至关熏要的，* 细胞凋亡明显影响胚胎和婴儿发育的所有方面。
* 细胞DNA损伤可诱导抑癌基因p53的表达。它使细胞停滞于G1期，以便提供足够的时间对损伤的DNA进行修复(参见第四章)。在细胞损伤严重以致修复无能的情况下，p53则触发细胞凋亡。
* 细胞凋亡和衰老密切相关。1. 清除损伤或无功能的细胞，并以新细胞替代之，从而保持组织自稳态；2. 清除不可替代的分裂后细胞如神经元、心肌细胞，使机体免患疾病。
第二节细胞凋亡的发生机制
* 细胞凋亡的发生发展过程可划分为三个时期，即诱导期、效应期和降解期。
* 最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。
* 它们诱导和调控细胞凋亡的基本机制是：
* Ced-3是具严格底物特异性的"半胱氨酸蛋白酶"。它通常以酶原(前体)的形式存在于细胞内。
* 细胞凋亡时，活化的Ced-3特异地降解蛋白底物，诱导凋亡细胞的特征性形态学和生物化学变化。
* Ced-4既能结合Ced-3，也能与Ced-9结合。
* 在非凋亡细胞，Ced-9以Ced-4为中介和Ced-3结合成三体复合物，扣押Ced-3使其以无活性的酶原形式存在于细胞内。
* 在凋亡诱导信号的作用下，Ced-9自复合物中解离。这可能与新近发现的EGL-1有关。
* EGL-1能够结合Ced-9.并替代三体复合物中的Ced-4/Ced-3，导致Ced-3在Ced-4的用下活化，并促使细胞凋亡。
* Ced-3和Ced-9在人体的类似物分别代表两大家族，即Caspases家族和Bcl-2家族
* 与Ced-4同源的只有凋亡活化因子(Apaf-l)。
* 哺乳动物细胞凋亡机制的认识?已经发展为两种概念。
* 其一，Caspase在细胞凋亡过程中发挥重要作用。
* 其二，过去从凋亡细胞主要表现为细胞核的改变出发，提出细胞凋亡发生的始动环节存在于细胞核。新近研究显示细胞核的改变是细胞凋亡的结果，而不是其原因。
一、Caspases和细胞凋亡
Caspases 1993年，袁钧英等发现Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1?转化酶(interlukin -? converting enzyme, ICE)存在功能和序列相似性。和Ced3一样，ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。随后发现14个ICE/Ced-3家族成原。为了避免命名上的混乱，袁钧英等在1996年10月组成了一个专门小组，推荐将ICE/ced-3家族成员统一命名为Caspase (Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases)，而对其家族成员，则按发现先后为序，在Caspases后以阿拉伯数字表示。
(一)Caspases的结构和活性特点
* Caspases家族有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。它们都以酶原形式表达。
* Caspase酶原由?原结构域(prodomain)、大亚基和小亚基构成。
* Caspase属于?半胱氨酸蛋白酶。严格的底物特异性，即异常特异地剪切天冬氨酸残基后的肽键(Asp-X)。
* Caspase的活性也显示高度有效性。
(二) Caspase的活化机制和死亡受体(p153)
* Caspase前体在活细胞中大量存在、表达，在凋亡时才被快速活化
* 凋亡中的Caspase可分为?始动或上游(如Caspase-2，8-10等)和效应或下游Caspase (如Caspase-3，6和7)两大类。
* 在凋亡诱导信号的作用下，始动Caspase通过结合特异辅因子而活化。活化的始动Caspase进一步活化效应Caspase。正是效应Caspase参与凋亡降解期中发生的重要底物的剪切。
* 死亡受体(death receptor，DR)是指能够通过与其相应的死亡配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞表面蛋白。它们主要包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族。
* 该家族成员除了具有相似的、富集半胱氨酸的细胞外结构域外，其胞浆区内包含死亡结构域(death domain，DD)。
* 在Fas/Fas配体(FasL)信号途径中，Fas相关的死亡结构域蛋白(Fas associated death domain)，FADD)具重要作用。
* FADD分子除了包含DD结构外，也含死亡效应结构域(Death effector domain，DED)。
* FasL分子以三聚体形式和三个Fas分子交联，导致Fas的DD成簇。后者以其DD为中介结合FADD，形成死亡诱导信号复合体(death inducing signal complex，DISC)。随后，FADD通过其DED结构域和Caspase8的DED区相互作用，导致Caspase 8形成寡聚体，并驱使其自身活化。活化的Caspase 8进一步活化效应Caspase，如Caspase-3等，使细胞发生凋亡。
* TNF具有多重生物学效应。它通过结合TNF-R1，活化转录因子NFkB和AP-l，诱导促炎症和免疫调节基因的表达。
* TNF也通过TNF-R1诱导细胞凋亡。
* TNF和TNF-R1的结合导致TNF-Rl形成同三聚体。随后，TNF-R1的DD乃与TNFR相关的死亡结构域蛋白(TRADD)分子的DD交联。
* TRADD分子的DD作为辅助因子分别结合TRAF2(TNF receptor-associated factor)和RIP(receptor interacting protein)结合，导致NF-kB和AP-1的活化，而与FADD的结合则通过和Fas/FasL相同的途径诱导细胞凋亡。
Caspases的作用底物
根据其生物学功能，Caspase划分为两个亚家族：它们分别以Ced-3和ICE为代丧。其中，ICE亚家族(Caspase-1，4，5)主要辅助促炎症反应，而Ced-3亚家族(Caspases2，3，6，7，8，9，)则主要参与细胞凋亡过程。3、6、7还是效应分子。
提示Caspase可能通过如下几种机制参与凋亡过程：
* 灭活细胞凋亡抑制蛋白：Caspases对ICAD的剪切。Caspases活化的DNA酶(caspase activated deoxyribonudease，CAD)可能是导致凋亡细胞发生非随机性DNA降解的特定核酸酶。在非凋亡细胞，CAD和其抑制物(Inhibitor of CAD，ICAD)结合形成无活性复合物。细胞凋亡时，Caspase剪切ICAD，并致其失活。于是，CAD游离并进入细胞核内降解DNA。
* 剪切细胞结构蛋白：核板(nuclear lamina)的解体。细胞凋亡过程中，Caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷和染色质浓缩。
* 剪切细胞效应蛋白：Caspase可能作用于DNA修复、mRNA拼接和DNA复制相关蛋白，使其活性丧失或失调。
总之，Caspase是细胞凋亡调控的关键分子群。它们通过切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、关闭DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等，在细胞凋亡过程中起着重要作用。
二、线粒体和细胞凋亡
* 细胞游离系统(cell-frees system)：于完整细胞中将细胞核和细胞浆分离，制备无核细胞(cytoplast)和裸核细胞。它可以独立分析细胞浆和细胞核在细胞凋亡中的作用。
* 细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱，并认为是导致细胞不可逆性死亡的关键环节。
(一)细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的变化
* 线粒体是由双层膜包裹的囊状结构。外膜通透性较大，内膜通透性小，内膜存在一些载体蛋白和通道如质子泵。能有效地将线粒体基质内的质子泵入外室，从而形成横跨线粒体内膜、表现为内负外正的线粒体跨膜电位(mitochondrial transnlembrane potential，??m)。
* 几乎所有凋亡时都伴随??m下降。
* ??m下降多发生在凋亡的形态学和生物化学改变之前
* 线粒体跨膜电位的维持依赖"线粒体膜通透性转运孔"(mitochondrial permeabilityTransition pore，MPT)，定位于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体。
* 在生理情况下，MPT呈周期性开放，使外室里的质子进入基质，从而防止质子在外室过度蓄积。然而，MPT的持续开放和关闭则分别诱导和抑制细胞凋亡。
* MPT抑制剂cyclosporine，对细胞凋亡也具抑制效应。相反，苍术苷和Bax则诱导MPT开放和细胞凋亡。
* 几乎所有诱导细胞凋亡的因素都可以造成MPT的破坏，* 这些因素又可进一步导致MPT的开放和??m的破坏。因此，MPT具有自我放大效应和很可能是一种"全或无"的开关。
(二)MPT开放导致线粒体释放Caspase活化物
* 在许多细胞凋亡模型中，MPT的开放伴随线粒体外膜的物理性损伤。
* 外膜的物理性损伤导致定位于线粒体外室的Caspase活化物的释放。
* 在死亡早期，细胞凋亡和细胞坏死具有相同的信号途径，即MPT破坏。
* 细胞色素C的释放究竟触发细胞凋亡还是细胞坏死主要取决于细胞类型。
* 在有足量细胞色素C可利用的细胞，氧消耗和ATP生成保持正常水于，MPT的破坏诱导Caspase活化和细胞凋亡。
* 在含大量内源性Caspase抑制剂的细胞，细胞色素C的释放并不能诱导Caspase依赖的细胞凋亡，相反导致电转运能力的破坏和氧消耗和ATP生成减少，进而触发细胞坏死。
* 在ATP存在时细胞走向凋亡。反之，则发生坏死。
* 除了细胞色素C外，线粒体也释放凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)
* AIF无核酸内切酶活性，但它可以直接活化下游Caspase，甚至直接裂解某些选择性底物，迅速诱导核凋亡。......（后略) ......
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