肝细胞生长因子对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用.pdf
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参见附件(291kb)。
肝细胞生长因子对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用3
邹 原 宫德正 孙丽娟1
梅懋华
(大连医科大学生理教研室,1
附属二院检验科, 大连 116023)
摘要 本工作采用无血清原代培养大鼠肝细胞法, 观察了重组人肝细胞生长因子 ( r2 hHGF) 对四氯化碳 (CCl4) 致
大鼠肝细胞损伤的保护作用。结果表明, r2 hHGF 对CCl4 染毒肝细胞有明显的保护作用。r2 hHGF 保护组较CCl4
染毒组细胞存活率显著升高, 细胞内丙氨酸转氨酶、钾离子漏出明显降低。结果提示, r2 hHGF 可减轻CCl4 对肝
细胞膜的损伤, 提高细胞膜的结构完整性。
关键词 肝细胞生长因子 丙氨酸转氨酶 钾离子 四氯化碳 肝细胞原代培养
X 肝细胞生长因子 (hepatocyte grow th facto r,HGF ) 是晚近新发现的生长因子[ 1 ]
, 是由分子量
75kD 的 A链和 30KD 的 B链通过二硫键连接而成
的二聚体。 HGF 在体内广泛分布, 是一多效性因子,具 有 促 细 胞 分 裂 (m itogen )、 促 细 胞 运 动
(mo togen)、促形态形成 (mo rphogen) 等作用。
大鼠肝部分切除 (PH) 或用CCl4 染毒, 其血浆
HGF 水平比对照组分别高17 倍和13 倍[ 2 ]。患暴发
性肝衰病人血中HGF 水平较正常人高30 倍[ 3 ]。我
们的前期工作表明, HGF 是最强的促肝细胞分裂
原, 在 10ng? m l剂量即可引起3
H2TdR 掺入率达到
最大。HGF 除具有促细胞增殖作用外, 是否还具有
保护作用目前尚未见报道。本工作采用原代培养大
鼠肝细胞, 观察HGF 对CCl4 染毒的大鼠肝细胞的
保护作用。
1 材料和方法
111 动物
采用Sp rague2 Daw ley (SD) 雄性大鼠 (本校实
验动物中心提供) , 体重180- 220g, 分笼饲养, 标
准鼠食, 自由饮水。
112 主要试剂
重组人肝细胞生长因子 ( r2 hHGF)、胶原酶 (ì
型)、胰岛素为Sigm a 公司产品 (St . Lou is, MO ,U SA ) ; RPM I21640 人工合成培养基为Gibco 产品
(Grand Island, N Y) ; 牛血清白蛋白 (BSA ) 为上海
松口精益试剂仪器厂产品; CCl4 (分析纯) 为沈阳市
虎石台化学试剂厂产品。
113 肝细胞的分离和原代培养
按照Seglen 法[ 4 ]
略加修改。简述如下: 轻度乙
醚麻醉大鼠, 剖腹后作门静脉插管, 剪断下腔静脉。
用D2 Hank s 液快速灌流以冲去残血, 灌速 30 -
40m l? m in, 约10m in 后换含0105%胶原酶的Hank s
液灌流, 灌速5m l? m in, 灌流10m in 左右。待肝脏
失去弹性, 肝包膜肿胀后, 取下肝脏, 轻轻撕去包
膜, 将肝细胞分散于预冷的Hank s 液中, 200 目滤网
滤过, 离心清洗三次 (600rpm , 40s, 800rpm , 50s
和1000rpm , 60s) , 将肝细胞悬浮于 5%小牛血清
(56℃, 30m in 补体灭活) 的RPM I21640 的培养液中
(RPM I21640 培养基, 青霉素 100U? m l, 链霉素
100Lg? m l, 胰岛素10- 8
mo l? L , 地塞米松10- 6
mo l?
L )。用 014%台盼蓝排除法测细胞存活率, 达90%
以上者用于实验。调细胞密度为2×105
细胞? m l, 接
种于24 孔细胞培养板 (Co star) 中, 置于饱和湿度,37℃及5% CO 2 的培养箱中培养。
114 CCl4 损伤法[5 ]
细胞接种培养18- 20h 后, 换以含 r2 hHGF 的
无血清RPM I21640 培养液继续培养24h, 加入20%
CCl4 乙醇溶液, CCl4 终浓度15mmo l? L。 40m in 后测
定培养液中的丙氨酸转氨酶 (AL T )、K+
漏出水平。
115 ALT、K+
漏出的测定
取染毒后培养液500Ll, 离心 (500rpm , 5m in) ,留上清。用Beckm an system E2A 离子分析仪 (美
国)测定上清液中K+
浓度, 以mmo l? L 表示; 用A b2
bo t t CCxê 型生化分析仪 (美国) 测定上清液中
AL T 活力, 以U? L 表示。
116 统计处理
各组数据以x q±s 表示, P 值经 t 检验。
2 结果
211 r-hHGF 对CCl4 染毒肝细胞存活率的影响
822 Ch in J App l Physio l 1997; 13 (3)
X 国家自然科学基金资助项目 (№. 39470275)
1996- 10- 14 收稿 1997- 3- 3 修回实验中将培养肝细胞分为四组: 对照组 (PBS
组和 r2 hHGF 组) , 染毒组 (CCl4 15mmo l? L ) , 保护
组 ( r2 hHGF 5ng? m l+ CCl4 15mmo l? L )。结果表明,CCl4 染毒后细胞存活率较对照组显著降低 (P <
0101, n= 6) ; 而r2 hHGF 可明显降低CCl4 致细胞死
亡率, 使其存活率升高 (P < 0101, n= 6)。
Tab1 Effect of r2 hHGF on the viability and the leakage
of int racellular po tassium of the cultured
hepatocytes expo sed to CCl4
V iability (% ) K+ (mmo l? L )
n 6 6
PBS 92±2 5113±0103
r2 hHGF (5ng? m l) 94±1 5120±0102
CCl4 (15mmo l? L ) 57±6+ + 5195±0111+ + +
r2 hHGF (5ng? m l) +
CCl4 (15mmo l? L )
72±63 3
5167±01113 3
+ +
P < 0101,+ + + P < 01001 compared w ith the PBS
group; 3 3
P < 0101, compared w ith the CCl4 group.
212 r-hHGF 对CCl4 染毒肝细胞ALT 漏出的影响
按上述四组(n= 6) , 分别测定细胞培养液AL T
的漏出量 ......
邹 原 宫德正 孙丽娟1
梅懋华
(大连医科大学生理教研室,1
附属二院检验科, 大连 116023)
摘要 本工作采用无血清原代培养大鼠肝细胞法, 观察了重组人肝细胞生长因子 ( r2 hHGF) 对四氯化碳 (CCl4) 致
大鼠肝细胞损伤的保护作用。结果表明, r2 hHGF 对CCl4 染毒肝细胞有明显的保护作用。r2 hHGF 保护组较CCl4
染毒组细胞存活率显著升高, 细胞内丙氨酸转氨酶、钾离子漏出明显降低。结果提示, r2 hHGF 可减轻CCl4 对肝
细胞膜的损伤, 提高细胞膜的结构完整性。
关键词 肝细胞生长因子 丙氨酸转氨酶 钾离子 四氯化碳 肝细胞原代培养
X 肝细胞生长因子 (hepatocyte grow th facto r,HGF ) 是晚近新发现的生长因子[ 1 ]
, 是由分子量
75kD 的 A链和 30KD 的 B链通过二硫键连接而成
的二聚体。 HGF 在体内广泛分布, 是一多效性因子,具 有 促 细 胞 分 裂 (m itogen )、 促 细 胞 运 动
(mo togen)、促形态形成 (mo rphogen) 等作用。
大鼠肝部分切除 (PH) 或用CCl4 染毒, 其血浆
HGF 水平比对照组分别高17 倍和13 倍[ 2 ]。患暴发
性肝衰病人血中HGF 水平较正常人高30 倍[ 3 ]。我
们的前期工作表明, HGF 是最强的促肝细胞分裂
原, 在 10ng? m l剂量即可引起3
H2TdR 掺入率达到
最大。HGF 除具有促细胞增殖作用外, 是否还具有
保护作用目前尚未见报道。本工作采用原代培养大
鼠肝细胞, 观察HGF 对CCl4 染毒的大鼠肝细胞的
保护作用。
1 材料和方法
111 动物
采用Sp rague2 Daw ley (SD) 雄性大鼠 (本校实
验动物中心提供) , 体重180- 220g, 分笼饲养, 标
准鼠食, 自由饮水。
112 主要试剂
重组人肝细胞生长因子 ( r2 hHGF)、胶原酶 (ì
型)、胰岛素为Sigm a 公司产品 (St . Lou is, MO ,U SA ) ; RPM I21640 人工合成培养基为Gibco 产品
(Grand Island, N Y) ; 牛血清白蛋白 (BSA ) 为上海
松口精益试剂仪器厂产品; CCl4 (分析纯) 为沈阳市
虎石台化学试剂厂产品。
113 肝细胞的分离和原代培养
按照Seglen 法[ 4 ]
略加修改。简述如下: 轻度乙
醚麻醉大鼠, 剖腹后作门静脉插管, 剪断下腔静脉。
用D2 Hank s 液快速灌流以冲去残血, 灌速 30 -
40m l? m in, 约10m in 后换含0105%胶原酶的Hank s
液灌流, 灌速5m l? m in, 灌流10m in 左右。待肝脏
失去弹性, 肝包膜肿胀后, 取下肝脏, 轻轻撕去包
膜, 将肝细胞分散于预冷的Hank s 液中, 200 目滤网
滤过, 离心清洗三次 (600rpm , 40s, 800rpm , 50s
和1000rpm , 60s) , 将肝细胞悬浮于 5%小牛血清
(56℃, 30m in 补体灭活) 的RPM I21640 的培养液中
(RPM I21640 培养基, 青霉素 100U? m l, 链霉素
100Lg? m l, 胰岛素10- 8
mo l? L , 地塞米松10- 6
mo l?
L )。用 014%台盼蓝排除法测细胞存活率, 达90%
以上者用于实验。调细胞密度为2×105
细胞? m l, 接
种于24 孔细胞培养板 (Co star) 中, 置于饱和湿度,37℃及5% CO 2 的培养箱中培养。
114 CCl4 损伤法[5 ]
细胞接种培养18- 20h 后, 换以含 r2 hHGF 的
无血清RPM I21640 培养液继续培养24h, 加入20%
CCl4 乙醇溶液, CCl4 终浓度15mmo l? L。 40m in 后测
定培养液中的丙氨酸转氨酶 (AL T )、K+
漏出水平。
115 ALT、K+
漏出的测定
取染毒后培养液500Ll, 离心 (500rpm , 5m in) ,留上清。用Beckm an system E2A 离子分析仪 (美
国)测定上清液中K+
浓度, 以mmo l? L 表示; 用A b2
bo t t CCxê 型生化分析仪 (美国) 测定上清液中
AL T 活力, 以U? L 表示。
116 统计处理
各组数据以x q±s 表示, P 值经 t 检验。
2 结果
211 r-hHGF 对CCl4 染毒肝细胞存活率的影响
822 Ch in J App l Physio l 1997; 13 (3)
X 国家自然科学基金资助项目 (№. 39470275)
1996- 10- 14 收稿 1997- 3- 3 修回实验中将培养肝细胞分为四组: 对照组 (PBS
组和 r2 hHGF 组) , 染毒组 (CCl4 15mmo l? L ) , 保护
组 ( r2 hHGF 5ng? m l+ CCl4 15mmo l? L )。结果表明,CCl4 染毒后细胞存活率较对照组显著降低 (P <
0101, n= 6) ; 而r2 hHGF 可明显降低CCl4 致细胞死
亡率, 使其存活率升高 (P < 0101, n= 6)。
Tab1 Effect of r2 hHGF on the viability and the leakage
of int racellular po tassium of the cultured
hepatocytes expo sed to CCl4
V iability (% ) K+ (mmo l? L )
n 6 6
PBS 92±2 5113±0103
r2 hHGF (5ng? m l) 94±1 5120±0102
CCl4 (15mmo l? L ) 57±6+ + 5195±0111+ + +
r2 hHGF (5ng? m l) +
CCl4 (15mmo l? L )
72±63 3
5167±01113 3
+ +
P < 0101,+ + + P < 01001 compared w ith the PBS
group; 3 3
P < 0101, compared w ith the CCl4 group.
212 r-hHGF 对CCl4 染毒肝细胞ALT 漏出的影响
按上述四组(n= 6) , 分别测定细胞培养液AL T
的漏出量 ......
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